人乳头瘤病毒31和33亚型L1基因导入水稻及转基因植株的鉴定

孟凤丽，张改平，刘运超，陈玉梅，王聚财，祁艳华，冉云伟，王爱萍

1.郑州大学 生命科学学院，河南 郑州 450001；2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002

人乳头瘤病毒31和33亚型L1基因导入水稻及转基因植株的鉴定

孟凤丽1，张改平2，刘运超2，陈玉梅1，王聚财2，祁艳华1，冉云伟1，王爱萍1

1.郑州大学 生命科学学院，河南 郑州 450001；2.河南省农业科学院 动物免疫学重点实验室，河南 郑州 450002

目的：结合水稻胚乳生物反应器的优点，将人乳头瘤病毒（HPV）31、33亚型的L1蛋白编码基因导入水稻，构建HPV31 L1、HPV33 L1植物表达载体，最终实现其在水稻胚乳表达系统中的表达。方法：利用生物信息学方法分析并优化合成HPV31及HPV33 L1蛋白编码基因，将其重组于中间载体pMP3和植物表达载体pCAMBIA1300中，分别构建植物双元表达载体pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1，采用遗传转化法经根癌农杆菌介导转化水稻TP309种子的愈伤组织，经共培养、潮霉素筛选和分化再生，获得潮霉素抗性植株。结果和结论：构建了HPV31 L1、HPV33 L1的植物表达载体，经根癌农杆菌介导转化水稻TP309种子的愈伤组织，获得转基因植株。

人乳头瘤病毒L1基因；根癌农杆菌；水稻胚乳表达系统；遗传转化；植物表达载体

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在全球女性癌症死亡率中居第2位，仅次于乳腺癌[1-2]，全球每年约有50万新发病例，约20万死于宫颈癌。宫颈癌与生殖道人乳头瘤病毒（human papil⁃lomavirus，HPV）感染有密切关系，99.7％以上的宫颈癌病例伴有HPV感染[3]。HPV属于乳头瘤病毒科、乳头瘤空泡病毒A属，是一类双链小分子DNA病毒，直径45～55nm，衣壳呈二十面体立体对称，含72个衣壳亚单位，没有囊膜。该病毒有严格的种属特异性，主要感染人的皮肤和黏膜组织，引起相应部位上皮组织的增生性病变[4]。近年来，HPV感染呈明显增多趋势，因此HPV预防性疫苗的研究成为防控宫颈癌研究的热点[5-6]。重组表达的HPV L1蛋白可在体外自组装成病毒样颗粒（virus-like particles，VLPs），并诱发机体产生保护性免疫应答[7-8]，可有效预防HPV感染。

转基因植物表达系统是一种高效、廉价的制备外源蛋白的表达系统，在生物制药、疫苗等研究领域应用广泛。植物的转基因操作主要有基因枪法、PEG法、电极法等[9]。双子叶植物的转基因主要采用农杆菌介导的方法。Mason等利用烟草和马铃薯表达了乙型肝炎病毒抗原和诺沃克病毒HBsAg抗原成分[10-11]；Warzecha等利用马铃薯表达了HPV11-L1-NLS L1蛋白[12]，并证实所表达的病毒衣壳蛋白能组装成VLPs。鉴于农杆菌介导的基因转移是双子叶植物中运用广泛而有效的遗传转化系统，因此有许多学者尝试将这一体系用于水稻的基因转化[14]。Yang等利用水稻表达了重组人血清白蛋白OsrHSA[13]，Huang等则利用水稻表达了人乳铁蛋白[15]。

在本研究中，我们利用生物信息学方法分析HPV31、HPV33不同变异株的L1基因序列，再根据水稻密码子偏爱性和mRNA结构优化并合成HPV31和HPV33的L1基因，分别克隆于植物表达载体，通过根癌农杆菌介导的转化方法将其转入水稻种子愈伤组织，获得表达HPV31 L1、HPV33 L1蛋白的转基因水稻植株，为开发HPV31 L1、HPV33 L1疫苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

水稻种子TP309、根癌农杆菌EHA105、中间载体pMP3、植物表达载体pCAMBIA1300由武汉禾元科技股份有限生物公司提供；大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）感受态细胞购于TaKaRa公司；质粒pUC57-HPV31 L1及pUC57-HPV33 L1由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。各种工具酶购自NEB公司；PCR beads购自Amersham Phar⁃macia公司；头孢霉素（Cef）、羧苄青霉素（Cb）、卡那霉素（Kan）、乙酰丁香酮（AS）和植物激素6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、激动素（KT）等购自Biosharp公司；潮霉素（Hyg）购自Roche公司；质粒提取试剂盒、切胶回收试剂盒购自Axygen公司。

研究过程所用培养基按文献方法配制[16-17]。MS为基本培养基，各培养基附加蔗糖30g/L、琼脂7.5g/L，pH值调至5.8。种子发芽培养基为1/2MS；种子诱导培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L；共培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L；选择培养基为MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+Hyg 10 mg/L+Cb 400 mg/L；生根培养基为1/2 MS+NAA 0.05 mg/L+Hyg 10 mg/L+Cb 200 mg/L。

1.2 目的基因及引物的设计与合成

根据大肠杆菌密码子的偏爱性优化HPV31及HPV33的L1蛋白编码区基因，委托上海生工生物工程有限公司合成，合成的基因分别命名为pUC57-HPV31 L1和pUC57-HPV33 L1。在合成基因的5'端和3'端分别引入MlyⅠ、XhoⅠ酶切位点，并设计合成相应的鉴定用引物（表1）。

1.3 构建HPV31、HPV33 L1中间载体

将优化合成的pUC57-HPV31 L1和pUC57-HPV33 L1基因用XhoⅠ和MlyⅠ双酶切，获得HPV L1蛋白编码区基因序列；将pMP3载体用XhoⅠ和NaeⅠ双酶切，获得含有启动子Gt13a、信号肽序列SP的序列；将上述双酶切的序列用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，连接产物分别转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，构建含有启动子Gt13a、信号肽序列SP的中间载体pMP3-HPV31 L1和pMP3-HPV33 L1，经菌液PCR鉴定和双酶切鉴定后用于构建植物表达载体。

1.4 构建HPV31、HPV33 L1重组植物表达载体载体

将构建的中间载体和含有潮霉素抗性基因的植物表达载体pCAMBIA1300用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切，切胶回收目的基因，用T4DNA连接酶于16℃连接过夜，构建含有水稻特异性启动Gt13a、信号肽序列SP、潮霉素抗性基因及HPV31 L1和HPV33 L1基因的水稻胚乳特异性表达载体，经菌液PCR鉴定和双酶切及测序鉴定，将构建的重组表达质粒命名为pCAM⁃BIA1300-pMP3-HPV-31L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1。

1.5 重组植物表达载体转入根癌农杆菌EHA105

分别用电穿孔法将构建的水稻胚乳特异性表达载体pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1导入根癌农杆菌EHA105感受态细胞，涂于含链霉素（100 mg/L）及卡那霉素（50 mg/L）的YEB选择培养基，经PCR及酶切鉴定后的阳性菌落用于植物转化。

1.6 水稻的遗传转化

选取饱满、大小一致、新鲜的水稻种子置于37℃恒温箱中1～2d；在无菌条件下先后用75％乙醇对水稻种子消毒30s、20％次氯酸钠消毒（加入1～2滴吐温 20）10min，无菌水冲洗 4～5次，用无菌滤纸吸干水分后，接种于种子诱导培养基中，于26℃光照预培养10d；挑取淡黄色的生长状态良好的愈伤组织，置于含重组质粒的根癌农杆菌EHA105（D600nm=0.6～0.8）侵染液中侵染30～45min，侵染期间须不时摇动；侵染结束后，弃菌液，用无菌滤纸吸干残留菌液，接种于共培养基上，于25℃暗培养3～4d；用无菌水洗去未侵入愈伤组织的农杆菌，然后用加了头孢霉素的无菌水抑制农杆菌的生长，用无菌滤纸吸干水分后转入筛选培养基，26℃暗培养30d；挑选新长出来的朝下与筛选培养基表面接触的嫩黄色凝结成块的愈伤组织，将其转入分化培养基，于26℃光照条件下培养30d；将分化成的苗转入生根培养基，于26℃光照条件下生根培养30d；将水稻苗移栽至土壤中，温室培养。

表1 所用引物列表

1.7 转基因水稻的PCR检测

剪取200 mg新鲜叶片，65℃干燥后研磨成粉末，用CTAB法提取总DNA，干燥后溶于100μL TE中。取1μL总DNA作为模板，用HPV31、HPV33 L1上下游引物进行PCR扩增（扩增条件：95℃预变性 10min；95℃ 30s，55℃ 30s，72℃90s，30个循环；72℃延伸 10min），PCR 产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2 结果

2.1 中间载体的构建与鉴定

中间表达载体pMP3-HPV-31-L1和pMP3-HPV-33-L1含有启动子Gt13a、信号肽序列SP及L1蛋白编码区基因（图1A），经化学转化法导入大肠杆菌感受态细胞DH5α，其菌液PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，在约458、445bp处可见特异性条带，大小与预期相符（图1B）。提取质粒用HindⅢ/EcoRⅠ双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，可见2条与预期相符的条带（图1C）。测序（序列未示）证实HPV31 L1和HPV33 L1编码区基因成功插入中间载体pMP3。

2.2 植物表达载体的构建与鉴定

植物表达载体pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1含有水稻特异性启动Gt13a、信号肽序列SP、潮霉素抗性基因及L1蛋白编码区基因（图2A），经化学转化法导入大肠杆菌DH5α感受态细胞，其菌液PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析，在约458、445bp处可见特异性条带，大小与预期相符（图2 B）。提取质粒用HindⅢ/EcoRⅠ双酶切，有2条与预期大小相符的条带（图2C）。测序（序列未示）证实HPV31 L1和HPV33 L1编码区基因成功插入植物载体pCAMBIA1300。

2.3 植物表达载体转入根癌农杆菌EHA105

将构建的水稻特异性表达载体用电穿孔法[12]转入根癌农杆菌EHA105，挑取单克隆，菌液PCR可扩增到HPV31、HPV33 L1基因片段（图3），证实植物表达载体pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1已导入根癌农杆菌，与根癌农杆菌中的Ti质粒共同构成植物表达双元载体。

2.4 转基因水稻植株的PCR鉴定

分别用含有pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1和pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1的根癌农杆菌EHA105浸染水稻种子愈伤组织，经筛选、分化、生根培养，移栽至土壤中，采取叶片提取其基因组DNA进行PCR鉴定，结果如图4、5所示。经T0代HPV31叶片PCR鉴定，共筛选出35株HPV31 L1基因（458bp左右有目的条带）PCR阳性的转基因水稻植株；经T0代HPV33叶片PCR鉴定，共筛选出38株HPV33 L1基因（445bp左右有目的条带）PCR阳性的转基因水稻植株。

图1 中间载体pMP3-HPV31 L1、pMP3-HPV 33 L1的构建及鉴定

3 讨论

图2 植物表达载体pCAMBIA1300-pMP3-HPV31 L1、pCAMBIA1300-pMP3-HPV33 L1的构建及鉴定

HPV感染与宫颈癌的发生和发展密切相关，因此研制预防性疫苗以防止HPV的感染极为重要。HPV预防性疫苗主要是基于L1蛋白自组装或L1、L2蛋白共同组装形成的VLP疫苗[7-8]。研究证实，这类VLP疫苗能诱发机体产生持久的保护性免疫反应，从而阻断病毒入侵宿主细胞[18-19]。用酵母表达系统或杆状病毒表达系统获得的L1 VLP疫苗已获批进入市场，但这种疫苗的生产成本较高，使其在发展中国家的推广应用受到限制。因此，尝试发展新的廉价表达系统生产疫苗仍是目前研究的热点。

近年来，转基因植物作为生物反应器生产药用生物大分子的研究在不断深入，利用转基因植物生产HPV VLP疫苗是一条可探索的途径。水稻是分子生物学研究的模式作物之一，遗传转化已成为水稻分子生物学研究和基因工程的必需手段。He等应用水稻胚乳表达系统表达的人血清白蛋白OsrHSA产量可达2.75g/kg，占水稻可溶性蛋白总量的10.58％，且纯度高达99.9％[13]；An等应用水稻胚乳表达系统表达的碱性成纤维细胞生长因子OsrbFGF产量可达8.33 mg/kg，纯度高达95％[20]，表明水稻胚乳表达系统作为一种新的植物表达系统可表达外源重组蛋白。

我们构建的植物重组表达载体pCAM⁃BIA1300-pMP3-HPV-31L1及pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1具有完整的植物表达调控元件，如组成型启动子Gt13a、植物筛选标志及左右边界序列，同时含有目的蛋白HPV31 L1或HPV33 L1的编码区基因，可与农杆菌中的Ti辅助质粒构成植物双元表达载体，为HPV31或HPV33 L1基因转入水稻胚乳奠定了基础。随后我们用转化的含有HPV31、HPV33 L1基因的重组表达菌株分别浸染水稻种子愈伤组织，最终得到了含有目的基因的水稻植株，说明我们构建的植物双元表达载体适用于根癌农杆菌介导的植物转化，为HPV31或HPV33亚型L1蛋白在水稻胚乳表达系统中的表达奠定了基础。

图3 根癌农杆菌EHA105菌液PCR鉴定

图4 T0代HPV31转基因水稻植株叶片DNA的PCR鉴定

图5 T0代HPV33转基因水稻植株叶片DNA的PCR鉴定

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Construction and Identification of HPV31 L1 and HPV33 L1 Transgenic Rice Plants

MENG Feng-Li1,ZHANG Gai-Ping2,LIU Yun-Chao2,CHEN Yu-Mei1,WANG Ju-Cai2,QI Yan-Hua1,RAN Yun-Wei1,WANG Ai-Ping1*
1.School of Life Science,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001;2.Key Laboratory of Animal Immunology,Henan Academy of Agricultural Sciences,Zhengzhou 450002;China
*Corresponding author,E-mail:pingaw@126.com

Objective:Based on the advantages of rice endosperm bioreactor,we constructed human papillomavi⁃rus（HPV） 31 L1 and HPV33 L1 plant expression vectors by introducing the HPV31 L1,HPV33 L1 genes into rice,for expressing the HPV31 L1,HPV33 L1 protein in rice endosperm expression system.Methods:The encod⁃ing genes of HPV31 and HPV33 L1 protein were synthesized by using bioinformatics analysis and optimization,and subcloned into the intermediate vector pMP3 and expression vector pCAMBIA1300.The binary expression vec⁃tors pCAMBIA1300-pMP3-HPV-31 L1 and pCAMBIA1300-pMP3-HPV-33 L1 were transformated into TP309 rice seed callus via Agrobacterium-mediated method.Some hygromycin-resistance plants were obtained by antibiotic screening and calli regenerated.Results&Conclusion:The HPV31 and HPV33 L1 genes were introduced into rice via Agrobacterium-mediated transformation by using the rice mature embryo-derived callus as explants.

human papillomavirus L1 gene;Agrobacterium tumefaciens;rice endospermcells bioreactor;genetic transformation;plant expression vector

Q943.2

A

1009-0002（2017）04-0465-06

2017-01-12

河南省高校科技创新团队和创新人才支持计划（14HASTIT027）

孟凤丽（1990- ），女，硕士，（E-mail）2298273675@qq.com

王爱萍，（E-mail）pingaw@126.com

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.012