神经菌毛素1b结构域的克隆及表达

孔苗苗，戴长松，葛凡，张海霞，沈颖，戴华

扬州大学 江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室，江苏省中西医结合老年病防治重点实验室，医学院，江苏 扬州 225001

神经菌毛素1b结构域的克隆及表达

孔苗苗，戴长松，葛凡，张海霞，沈颖，戴华

扬州大学 江苏省非编码RNA基础与临床转化重点实验室，江苏省中西医结合老年病防治重点实验室，医学院，江苏 扬州 225001

目的：制备重组人神经菌毛素1（NRP1）b结构域蛋白。方法：采用PCR技术，从pGEM-NRP1克隆载体中扩增人NRP1b结构域（HuNRP1b）cDNA，并将其克隆入pColdTF，构建重组原核表达质粒pCold-HuNRP1b并转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态，制备重组大肠杆菌BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b），低温条件下用IPTG诱导重组菌的表达，制备重组蛋白TF-HuNRP1b。结果：酶切、测序结果表明pCold-HuNRP1b构建成功，经SDS-PAGE分析，重组质粒转化表达菌后重组蛋白TF-HuNRP1b获得表达，融合蛋白相对分子质量约90×103。结论：获得原核表达的重组HuNRP1b蛋白，为该蛋白的规模化生产及其单克隆抗体的制备提供了有效的生物材料。

神经菌毛素1；cDNA；克隆；重组蛋白

神经菌毛素 1（neuropilin 1，NRP1）是一种多功能的非酪氨酸激酶受体，其最初作为轴突导向因子 3（semaphorin 3，Sema3）的受体在神经系统发育中具有调控神经元细胞的导向以及轴突生长的功能[1]。进一步的研究发现，NRP1在血管内皮细胞及多种肿瘤细胞表面高表达，是血管内皮细胞生长因子 165（VEGF165）的共受体[2]。NRP1 的相对分子质量为 130×103～140×103，由胞内区、跨膜区及较长的胞外区组成，其胞外区又分a1/a2、b1/b2、c等3个结构域[3]。NRP1通过其胞外区b结构域与VEGF165结合，显著提高VEGF165与血管内皮细胞生长因子受体2（VEGFR2，KDR）的结合能力，促进血管发育生成[4-5]。阻断VEGF165与NRP1的结合，不仅能直接抑制肿瘤细胞的迁移，抑制移植瘤的形成，而且还能抑制肿瘤局部血管生成，间接抑制肿瘤生长[6-7]。由于其在肿瘤发生发展中所起的病理性促进作用，NRP1逐渐成为继VEGFR后抗肿瘤治疗的新靶标。我们采用基因工程技术克隆得到人NRP1b结构域（HuNRP1b）cDNA，并对其进行表达、纯化，以期获得重组HuNRP1b蛋白，为研发抗HuNRP1抗体，进一步研究NRP1的功能提供有效的生物材料。

1 材料与方法

1.1 材料

大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞购自Trans⁃Gen Biotech公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞由本实验室制备、保存；克隆载体pGEM-NRP1（含HuNRP1全长cDNA）购自Sino Biological公司；质粒pColdTF，限制性核酸内切酶NdeⅠ、XhoⅠ购自TaKaRa公司；T4DNA连接酶购自Fermentas公司；超滤离心管购自Millipore公司；Axygen小量提取质粒试剂、AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒均购自爱思进生物技术有限公司；其他国产分析纯试剂均购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 HuNRP1b编码基因的克隆

根据GenBank公布的HuNRP1基因mRNA序列，采用Primer Premier 5.0软件辅助设计上下游引物，以pGEM-NRP1为模板，扩增HuNRP1b区cDNA，同时引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点。

引物为 P1（5'-GGGCATATGAAATGTATGGA AGCTCTGGGCAT-3'，下划线为NdeⅠ酶切位点）和 P2（5'-ATTCTCGAGACAGCCCAGCAGCTCCAT TCT-3'，下划线为XhoⅠ酶切位点）。PCR扩增条件：94℃ 5min；94℃ 50s，65℃ 40s，72℃ 40s，共30个循环；72℃延伸10min。将扩增的PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，切取目的条带，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒切胶回收，回收产物用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，并同时双酶切载体pColdTF，37℃酶切过夜。次日，双酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，分别切取载体及目的片段条带，用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒回收，-20℃保存。用T4DNA连接酶连接经双酶切的pColdTF载体、HuNRP1bcDNA片段，4℃连接过夜。次日，取5μL连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化菌涂布含氨苄西林（Amp）的LB平板，37℃培养过夜。次日随机挑选单菌落，37℃摇床220r/min振荡培养8h，同上步骤进行菌液PCR，同时以HuNRP1全基因cDNA为阳性对照，筛选阳性克隆子。将菌液PCR产物条带与阳性对照组条带位置一致的细菌，用Axygen小量提取质粒试剂盒提取质粒，双酶切鉴定。将双酶切鉴定正确的菌株送上海生工生物工程有限公司测序，测序正确的质粒命名为pCold-HuNRP1b。

1.3 重组大肠杆菌 BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b）的诱导表达及纯化

1.3.1 重组大肠杆菌 BL21（DE3）（pCold-HuN⁃RP1b）的诱导表达 将重组质粒pCold-HuNRP1b、空载体质粒pColdTF分别转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态，涂布含Amp的LB平板，37℃过夜培养。次日挑取单菌落，接种于5mL含Amp的LB培养基，37℃、220r/min振荡过夜培养，将新鲜培养的重组菌按1∶50的比例接种于含Amp的LB培养基中，37℃、220r/min振荡培养，待其D600nm达0.4左右，转入16℃摇床培养0.5h，分别加入0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mmol/L IPTG进行诱导，16℃连续培养24h，收取菌液。分别取1.0mL菌液，12 000r/min离心，PBS洗2次，用100μL PBS重悬，加入25μL 5×SDS 上样缓冲液，煮沸 10min。12％SDS-PAGE，上样量为 15μL，考马斯亮蓝染色0.5h后，脱色液脱色过夜，分析结果。

1.3.2 重组蛋白TF-HuNRP1b的可溶性表达分析取获得的诱导表达菌 BL21（DE3）（pCold-HuN⁃RP1b）、BL21（DE3）（pColdTF）各 1mL，同上离心洗涤后，超声波破碎细菌，离心收集细菌裂解上清及沉淀进行SDS-PAGE分析。

1.3.3 重组蛋白TF-HuNRP1b的大量诱导表达、浓缩 如上条件大量制备BL21（DE3）（pCold-HuN⁃RP1b）表达菌2 L，PBS洗涤后，用30mL的PBS重悬菌体沉淀，超声波破碎，同上离心，收集超声波裂解上清，采用Ni金属螯合层析柱（Bio-Scale Mini Profinity IMAC）纯化重组蛋白。采用30 kDa的超滤离心管，4℃、5500r/min离心，截流蛋白溶液体积至2mL左右，浓缩、提高纯化蛋白的浓度。继续采用4℃超滤离心法，用PBS缓冲液交换浓缩蛋白溶液中含有的高浓度咪唑，使得目的蛋白溶解于PBS缓冲液中，超滤离心管中加入10mL PBS，混匀，4℃、5500r/min离心，截流至2mL左右，重复此步骤5次。收集超滤离心管中的溶液，检测蛋白浓度，-70℃保存，用于后续免疫及检测。

2 结果

2.1 HuNRP1b编码基因cDNA的扩增及序列分析结果

以pGEM-NRP1为模板，扩增HuNRP1b基因cDNA，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后可见900bp左右的特异性条带，与GenBank公布的HuNRP1b区编码序列大小一致（图1）。

2.2 重组质粒pCold-HuNRP1b的构建

pColdTF、HuNRP1bcDNA片段经NdeⅠ、XhoⅠ双酶切、切胶回收、连接后转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布Amp+平板。次日，从转化的平板中随机挑取5个单菌落进行菌液PCR，图2第4、5、6泳道均出现900bp左右的条带，其大小与预期相符。取菌液PCR鉴定正确的菌液，用Axygen小量提取质粒试剂盒提取质粒，双酶切后电泳鉴定重组质粒，在约6kb及900bp位置出现2条清晰的条带，大小分别与质粒及目的片段大小一致（图3），测序结果表明重组质粒pCold-HuNRP1b构建正确（序列略）。

图1 HuNRP1b基因PCR扩增产物

2.3 重组大肠杆菌 BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b）的诱导表达及重组蛋白TF-HuNRP1b的可溶性分析

将鉴定正确的pCold-HuNRP1b转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态，重组菌 BL21（DE3）（pColdTMHuNRP1b）经 0.1、0.2、0.4、0.8、1.0mmol/L IPTG 诱导，经SDS-PAGE分析，在相对分子质量90×103处出现特异性条带，与预期目的蛋白一致，而且同样诱导的空载体表达菌 BL21（DE3）（pColdTF）在这一位置未见条带，仅在55×103处表达其标签蛋白，表明融合蛋白TF-HuNRP1b得到成功表达，且重组菌在0.4mmol/L IPTG下诱导，目的蛋白获得最佳表达（图4）。将诱导表达后的重组菌BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b）超声波裂解、离心，分别取上清、沉淀进行SDS-PAGE分析，结果表明融合蛋白主要以可溶蛋白的形式表达（图5）。

2.4 纯化重组蛋白TF-HuNRP1b

图2 菌液PCR分析重组菌

图3 重组质粒pCold-HuNRP1b的双酶切鉴定

重组菌 BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b）经 0.4mmol/L IPTG大量诱导后，超声波破碎，离心后收集上清进行Ni金属螯合层析柱纯化，纯化蛋白经截流、交换后经SDS-PAGE分析，表明目的蛋白得到有效纯化（图6）。

3 讨论

NRP1作为VEGF165的共受体，通过其b结构域与VEGF165结合，可明显增强VEGF165与VEGFR2的结合能力。阻断由VEGF165介导的NRP1与VEGFR2的结合，能提供最高效的拮抗VEGF165-VEGFR2信号转导的能力[8-9]。研究发现，NRP1可介导机体肿瘤细胞的免疫逃逸作用，其作用的发挥与b结构域密切相关，如Treg细胞表面的NRP1能够作为Sema4A、TGF-β的受体，促进Treg细胞的存活和功能，介导Treg细胞以趋化VEGF165的形式富集到肿瘤部位，抑制机体抗肿瘤能力以及对抗肿瘤治疗的效果。

大肠杆菌作为外源蛋白表达的宿主菌，具有遗传背景清晰、培养条件简单，生长速度快，表达产量高等优点。但其表达的外源蛋白容易聚集而产生没有活性的包涵体沉淀，包涵体需要经过复杂的溶解、复性、纯化才能获得有活性的蛋白，使得包涵体复性工作量大而复性蛋白得率低。本研究中采用了冷休克蛋白表达载体pColdTF，构建重组表达菌BL21（DE3）（pCold-HuNRP1b）后，经低温诱导，获得可溶性表达的融合蛋白TFHuNRP1b，且该表达系统带有组氨酸标签，便于目的蛋白的纯化。

综上，本研究为大量制备重组HuNRP1b提供了可能，为制备针对这一结构域的抗体及进一步研究HuNRP1蛋白的生物学功能提供了有效的生物材料。

图4 SDS-PAGE分析TF-HuNRP1b的表达

图5 SDS-PAGE分析重组蛋白TF-HuNRP1b的可溶性表达

图6 SDS-PAGE分析纯化的重组蛋白TF-HuNRP1b

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Cloning and Expression of Human Neuropilin 1b Domain

KONG Miao-Miao,DAI Chang-Song,GE Fan,ZHANG Hai-Xia,SHEN Ying,DAI Hua*
Jiangsu Key Laboratory of Experimental&Translational Non-Coding RNA Research,Key Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine for Prevention and Treatment of Senile Diseases,Medical School,Yang⁃zhou University,Yangzhou 225001,China
*Corresponding author,E-mail:daihua@yzu.edu.cn

Objective:To develop recombinant human neuropilin 1b domain（HuNRP1b）.Methods:cDNA of HuNRP1bwas amplified by PCR technique from pGEM-NRP1 cloning vector and then subcloned into plasmid pColdTF.After screening and sequencing,the constructed recombinant plasmid pCold-HuNRP1bwas transformed into competent cell E.coli BL21（DE3） and expressed by the induction of IPTG.Results:Enzyme digestion and DNA sequencing results showed that pCold-HuNRP1bwas successfully constructed.SDS-PAGE analysis showed that the expressed product was a fusion protein with a molecular weight of 90 kDa.Conclusion:Recombinant protein HuNRP1bwas successfully constructed,which has laid a foundation for the production of recombinant HuNRP1band development of monoclonal antibodies against HuNRP1b.

neuropilin 1;cDNA;cloning;recombinant protein

Q78

A

1009-0002（2017）04-0447-04

2017-01-17

国家自然科学基金（81472815）；江苏省大学生创新创业实践训练计划（201511117064Y）

孔苗苗（1995-），女，本科生；戴长松（1989-），男，硕士；二者为共同第一作者

戴华，（E-mail）daihua@yzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.04.008