40种中草药杀灭离体多子小瓜虫效果研究

王 彬，张其中，陈本亮，付耀武

（暨南大学水生生物研究所/热带亚热带水生态工程教育部工程研究中心/广东省高校水体富营养化与赤潮防治重点实验室，广东 广州 510632）

40种中草药杀灭离体多子小瓜虫效果研究

王 彬，张其中，陈本亮，付耀武

（暨南大学水生生物研究所/热带亚热带水生态工程教育部工程研究中心/广东省高校水体富营养化与赤潮防治重点实验室，广东 广州 510632）

研究了40种中草药不同浓度水提物对多子小瓜虫（Ichthyophthirius multifiliis）的离体杀灭效果，结果表明：夏枯草、仙鹤草和三七等18种中草药在浓度为50 g/L时才能在4 h内杀灭多子小瓜虫滋养体；药物浓度为10 g/L时，槐花、皂角刺和毛冬青等13种中草药可杀灭滋养体；药物浓度为1 g/L时，紫荆和鹅不食草即可杀灭滋养体；药物浓度为0.1 g/L时，只有生姜能杀灭多子小瓜虫滋养体。生姜水提物对滋养体和幼虫的最低致死浓度分别为100、50 mg/L，半数有效浓度分别为30.3、15.7 mg/L，100 mg/L可完全抑制包囊孵化。由此可见生姜是一种可有效杀灭多子小瓜虫的中草药。

中草药；生姜；杀虫活性；多子小瓜虫

多子小瓜虫（Ichthyophthirius multifiliis）属纤毛虫纲（Oligohymenophorea）凹口科（Ophryoglenidae）小瓜虫属（Ichthyophthirius），是淡水寄生纤毛原生动物，其生活史滋养体（寄生阶段）、包囊（离体繁殖阶段）和感染性幼虫（感染阶段）3个阶段［1］。该虫主要寄生在鱼鳃和皮肤上，致使鱼体分泌大量粘液，造成鱼呼吸困难，同时寄生处上皮细胞增生，出现许多小白点，因此，小瓜虫病又称“白点病”［2-3］。该病主要危害鱼苗和鱼种，严重时可引起病鱼大批死亡，造成严重经济损失。传统的化学防治药物（如孔雀石绿、硝酸亚汞、醋酸亚汞）［4-5］由于存在高毒高残留、污染环境、致癌致畸性等隐患而被禁用［6］。目前预防多子小瓜虫病的疫苗还处于研发阶段［7］。因此，研究安全高效的新型杀小瓜虫渔药迫在眉睫。

我国具有丰富的中草药资源，民间应用药用植物防治水产动物寄生虫病历史悠久［8］。由于中草药具有抗病毒、抗菌、抗应激、提高免疫及环境友好等诸多优点［9］，同时具有低毒、低残留等特点，符合无公害水产养殖业、生产绿色水产品的病害防治准则。因此，渔用植物源杀虫药受到人们广泛重视，已成为近年来研究和开发应用的热点。目前从五倍子、肉桂、桑白皮、白薇、姜黄、博落回、小果博落回中分离纯化出五没食子酰葡萄糖［10］、肉桂醛［11］、桑酮 G［12］、桑酮 O［12］、直立白薇苷 C［13］、姜黄素［14］、血根碱［15］、二氢血根碱和二氢白屈菜红碱［16］，经研究发现这些成分都具有良好的杀灭小瓜虫活性。Yi等［17］选取30种中草药的甲醇提取物进行杀多子小瓜虫活性实验，筛选出厚朴（Magnolia officinalis）和苦豆子（Sophora alopecuroides）两种杀虫效果最好的中药，它们对幼虫的EC50分别为2.45、3.43 mg/L。这为开发新型绿色环保药物防治多子小瓜虫病提供了新方向。

本研究挑选了40种中草药，通过试验煎煮水提液的杀多子小瓜虫滋养体活性，筛选出具有杀虫活性的中草药种类，进一步研究杀滋养体效果最好的植物种类的杀幼虫和抑制包囊孵化效果，以评价其用于防治多子小瓜虫病的前景。

1 材料与方法

1.1 试验材料

查阅中国药典（2005年版）一部，并根据其对中草药种类和药效记录情况，筛选出40种可能具有杀虫作用的植物（表1），用于杀灭离体小瓜虫药效研究。中草药均购于广州市石牌东路平价大药房。

1.2 试验方法

1.2.1 药液配制 每种中草药干燥粉碎后各取10 g，用400 mL蒸馏水浸泡8 h，沸水煎煮40 min，抽滤提取液，重复操作两次，合并滤液，再次煎煮浓缩至100 mL，使其终浓度为100 g/L。用蒸馏水以梯度稀释法依次往下稀释100 g/L中草药浓缩液至实验所需浓度，同时设置只加蒸馏水的空白对照。

1.2.2 多子小瓜虫的传代培养 实验于2016年5月在广州市水生野生动物保护基地进行，选取患多子小瓜虫病的草鱼，饲养于直径2 m的塑料鱼池中，将健康无损、体长13.2（±2.5）cm、体重45.8（±3.4）g的草鱼与其混养，每天更换1/3曝气充分的水，温度保持在24（±1）℃。当草鱼体表出现密集小白点时，收集小瓜虫用于实验，在被感染草鱼用完之前投入新的健康个体传接多子小瓜虫。

1.2.3 抑杀效果试验 （1）滋养体：用吸管将寄生于草鱼体表及鳃中成熟的小瓜虫滋养体冲洗下来，经漂洗滤去粘液等杂质，收集到培养皿中，取12孔板，各孔吸入1 mL约含200个滋养体的虫液，再分别加入1 mL不同浓度的药液，各药物浓度3个重复，温度保持在24（±1）℃，4倍物镜下观察记录各孔滋养体全部致死时间和死亡数。每次实验，观察以4 h为限，滋养体胞质流停止，纤毛停止摆动，表明虫体死亡。

（2）包囊：在24孔板中，于各孔中吸入1 mL约含100个滋养体的虫液，静置4～6 h待其形成包囊后，再分别加入1 mL不同浓度的药液，各药物浓度3个重复。将24孔板于24℃恒温培养箱中静置16～18 h，4倍物镜下观察孵化情况，计数各孔孵化幼虫数。具体方法为：充分

混匀幼虫液，用移液器取10 μL幼虫液，加入等体积1%福尔马林固定幼虫，放计数框内在4倍物镜下计数幼虫数，每孔计数3个样，求平均数，并最终计算平均每个包囊孵化的幼虫数（各孔幼虫总数/各孔包囊数）。包囊在药物处理后的48 h内未分裂，表明包囊死亡。

表1 供试中草药名录

（3）幼虫：将培养皿中收集到的小瓜虫滋养体在24℃恒温培养箱中培养18～22 h，直到释放感染性幼虫，充分混匀幼虫，调整虫液浓度（约1 000个/mL）。取24孔板，于各孔中吸入1 mL虫液，再分别加入1 mL不同浓度的药液，各药物浓度3个重复，4倍物镜下记录不同浓度中幼虫的致死时间。幼虫停止游动，其纤毛不动或仅微微摆动，很快变圆或裂解，表明幼虫死亡。

1.3 数据处理

用Excel 软件计算平均致死率、平均每个包囊孵化幼虫数及标准差（±SD），用SPSS22.0对数据进行统计学处理，分析不同剂量浓度致死结果的显著性差异及计算半数有效浓度（EC50）。

2 结果与分析

2.1 40种中草药水提物杀灭多子小瓜虫滋养体的致死时间比较

40种不同浓度的中草药水提物使全部滋养体死亡所需时间见表2。药物浓度为0.1 g/L时，只有生姜能杀灭多子小瓜虫滋养体，且致死时间为192 min；药物浓度为1 g/L时，紫荆和鹅不食草亦可杀灭滋养体，致死时间分别为21、89 min；药物浓度为10 g/L时，槐花、皂角刺和毛冬青等13种中草药才可在4 h内杀灭滋养体；夏枯草、仙鹤草和三七等18种中草药在浓度为50 g/L时才能杀灭滋养体；泽兰、女贞子和草果等6种中草药对滋养体无明显杀灭效果。对照组滋养体在4 h内没有死亡，形成包囊并孵化出感染性幼虫。可见，生姜杀滋养体效果最好，可进一步研究其药效。

2.2 生姜水提物对多子小瓜虫滋养体、幼虫的杀灭效果

不同浓度的生姜水提物处理多子小瓜虫滋养体和幼虫的死亡时间和4 h致死率见表3。使用浓度在100 mg/L时能100%杀灭滋养体，50 mg/L时作用4 h滋养体致死率为68.1%；杀灭幼虫实验中，作用浓度在50 mg/L以上时可在4 h内将幼虫全部杀死，25 mg/L作用4 h对幼虫致死率为76.4%。

表2 40种中草药水提物杀灭多子小瓜虫滋养体的致死时间（min）

表3 生姜水提物杀灭多子小瓜虫滋养体、幼虫的致死时间和致死率

用概率单位法（SPSS 22.0）计算生姜水提物对小瓜虫滋养体和感染性幼虫的半数有效浓度（EC50）分别为30.3、15.7 mg/L，95%置信区间分别为 19.5～48.1、9.8～24.6。

2.3 生姜水提物抑制多子小瓜虫包囊孵化活性

由表4可知，100 mg/L生姜水提物能在4 h内100%杀灭多子小瓜虫包囊，完全抑制包囊孵化，稀释一倍后对包囊的杀灭效果明显降低，4 h的包囊致死率仅为10.5%，但在随后的12 h孵化中，50 mg/L生姜水提物能显著降低每个存活包囊释放幼虫的数量，与对照组相比，处理组平均每个包囊仅孵化出76.5个幼虫；浓度为25、12.5 mg/L的处理组包囊孵化幼虫数与对照组相比差异显著。

表4 不同浓度生姜水提物抑制多子小瓜虫包囊孵化活性

3 讨论

本试验研究了40种中草药对多子小瓜虫的离体杀灭效果，结果表明，药物浓度为0.1 g/L时，只有生姜能够杀灭多子小瓜虫滋养体；药物浓度为1 g/L时，鹅不食草与紫荆等对滋养体也有明显杀灭作用；药物浓度为10 g/L时，槐花、皂角刺和毛冬青等13种中草药可杀灭滋养体；而夏枯草、仙鹤草和三七等18种中草药在浓度为50 g/L时才能在4 h内杀灭多子小瓜虫滋养体；泽兰、女贞子和草果等6种中草药对滋养体无明显杀灭效果。杀虫效果最佳的中草药是生姜，通过各阶段杀虫活性实验可知，其对小瓜虫滋养体、幼虫、包囊的抑杀效果与药物浓度呈正相关，浓度越高效果越好。另外，小瓜虫生活史各阶段虫体对药物的敏感度不同，滋养体（寄生阶段）比幼虫（感染阶段）难杀灭，100 mg/L时可将滋养体全部杀死，而杀灭感染性幼虫的最低有效浓度为50 mg/L，其对小瓜虫滋养体和感染性幼虫的半数有效浓度（EC50）分别为30.3、15.7 mg/L。包囊内虫体因外有包囊壁，药物难渗透进入其内，抑杀难度最大［18］。但从表4可以看出，100 mg/L浓度处理包囊即可完全抑制其孵化，包囊内虫体在分裂中途死亡，该实验结果与滋养体4 h内全部致死的最低浓度（100 mg/L）一致；包囊处理浓度稀释一倍（50 mg/L）可显著降低每个包囊释放幼虫的数量，与对照相比具有显著的抑制孵化作用。因此，药物浓度在50 mg/L时，对预防小瓜虫病有一定作用，浓度在100 mg/L以上时可杀灭各阶段虫体，起到有效的治疗效果。

本研究结果表明，大部分中草药在高浓度时都对小瓜虫均有一定抑杀效果，但高浓度药物对鱼体和水体存在安全隐患，且使用成本过高，因此实际应用价值不大。鉏超等［19］发现槟榔、乌梅、大黄、黄芩、贯众、乌药、枳壳等中草药对离体小瓜虫具有杀灭活性，0.1 g/L槟榔和乌梅对各个阶段的虫体均有杀灭效果，与生姜大致相当；0.1 g/L大黄和黄芩1 h内对幼虫有杀灭效果，1 g/L浓度能杀灭成虫和包囊，杀虫活性弱于生姜。热带植物剌毛黧豆（Mucuna pruriens）的叶粗提液和木瓜（Carica papaya）种子粗提物对多子小瓜虫的最低致死浓度分别为150、200 mg/L［20］，杀虫活性亦不如生姜。选择生姜作为今后开发新型绿色渔药的研究对象，不仅因其具有良好的药效，而且作为卫生部首批公布的药食兼用资源之一，其安全性将得到有效保障［21］。然而，生姜水提物虽具有显著灭杀多子小瓜虫的生物活性，但其有效成分和杀虫机理有待深入研究，后续实验将进一步研究其活性单体，并进行结构鉴定、药效、安全性评价和稳定性等分析，为开发制剂和进行仿生合成提供前期基础。

本研究证实生姜水提物对多子小瓜虫的滋养体（寄生阶段）、包囊（离体繁殖阶段）和幼虫（感染阶段）均有较强杀灭作用。与传统的化学药物相比，生姜克服了药物残留、毒副作用、污染环境等缺点，具有开发天然、绿色、环保型渔药的潜在价值。我国是生姜生产大国，资源丰富，其在新型环保渔药的开发和应用方面具有广阔前景［22］。本研究不仅为开发无公害环保杀虫渔药提供了理论依据和开发思路，也为下一步从中草药中分离纯化杀虫活性化合物提供了备选对象。

［1］Matthews RA.Ichthyophthirius multifiliisFouquet and Ichthyophthiriosis in Freshwater Teleosts［J］.Adv Parasitol，2005，59：159-241.

［2］Dickerson H W.Ichthyophthirius multifiliisandCryptocaryon irritans（phylum Ciliophora）［A］.Woo P T K. Fish Diseases and Disorders［M］.CAB International：Wallingford，2006：116-153.

［3］Dickerson H W.Ichthyophthirius multifiliis［A］. Woo PTK，Buchmann K. Fish Parasites：Pathobiology and Protection［M］. CAB International：Wallingford，2012：55-72.

［4］Buchmann K，Jensen P B，Kruse K D. Effects of sodium percarbonate and garlic extract onIchthyophthirius multifiliistheronts and tomocysts：In vitro experiments［J］. N Am J Aquacult，2003，65（1）：21-24.

［5］Wahli TSM，Meier W. Evluation of alternatives to malachite green oxalate as a therapeutant of ichthyophthiriosis in rainbow-trout，Oncorhynchus mykiss［J］. Appl Ichthyol，1993，9：237-249.

［6］白晓宁. 渔药使用中的问题及病害预防对策［J］. 宁夏农林科技，2010（6）：121-122.

［7］Dickerson H W，Findly R C. Immunity to ichthyophthirius infections in fish：a synopsis［J］.Dev Comp Immunol，2014，43：290-299.

［8］倪达书，李连祥. 多子小瓜虫的形态、生活史及其防治方法和一新种的描述［J］. 水生生物学，1960，2：197-215.

［9］Reverter M，Bontemps N，Lecchini D，et al.Use of plant extracts in fish aquaculture as an alternative to chemotherapy：Current status and future perspectives［J］. Aquaculture，2014，433：50-61.

［10］Zhang Q Z，Xu D H，Klesius P H. Evaluation of an antiparasitic compound extracted fromGalla chinensisagainst fish parasiteIchthyophthirius multifiliis［J］. Vet Parasitol，2013，198：45-53.

［11］梁靖涵，张其中，付耀武，等. 肉桂活性成分肉桂醛杀灭离体多子小瓜虫效果［J］. 水产学报，2014，38：457-463.

［12］Liang J H，Fu Y W，Zhang Q Z，et al.Identification and effect of two flavonoids from root bark ofMorus albaagainstIchthyophthirius multifiliisin grass carp［J］. J Agric Food Chem，2015，63：1452-1459.

［13］Fu Y W，Zhang Q Z，Xu D H，et al. Antiparasitic effect of cynatratoside-C fromCynanchum atratumagainstIchthyophthirius multifiliison grass carp［J］. J Agric Food Chem，2014，62：7183-7189.

［14］Liu Y M，Zhang Q Z，Xu D H，et al. Antiparasitic efficacy of curcumin fromCurcuma longaagainstIchthyophthirius multifiliisin grass carp［J］. Vet Parasitol，2017，236：128-136.

［15］Yao J Y，Shen J Y，Li X L，et al. Effect of sanguinarine from the leaves ofMacleaya cordataagainstIchthyophthirius multifiliisin grass carp（Ctenopharyngodon idella）［J］. Parasitol Res，2010，107（5）：1035-1042.

［16］Yao J Y，Zhou Z M，Li X L，et al. Antiparasitic efficacy of dihydrosanguinarine and dihydrochelerythrine fromMacleaya microcarpaagainstIchthyophthirius multifiliisin richadsin（Squaliobarbus curriculus）［J］. Vet Parasitol，2011，183（1）：8-13.

［17］Yi Y L，Lu C，Hu X G，et al. Antiprotozoal activity of medicinal plants againstIchthyophthirius multifiliisin goldfish（Carassius auratus）［J］.Parasitol Res，2012，111：1771-1778.

［18］陈达丽，张其中. 杀灭离体小瓜虫的药物试验［J］. 淡水渔业，2005，35（1）：45-46.

［19］鉏超，张其中，罗芬. 20种中草药杀灭离体小瓜虫的药效研究［J］. 淡水渔业，2010，40（1）：55-60.

［20］Ekanem A，Obiekezie A，Kloas W，et al. Effects of crude extracts ofMucuna pruriens（Fabaceae）andCarica papaya（Caricaceae） against the protozoan fish parasiteIchthyophthirius multifiliis［J］. Parasitol Res，2004，92（5）：361-366.

［21］林茂. 生姜有效成分的分离提取技术及组成研究［D］. 重庆：西南大学，2007.

［22］卢传坚，欧明，王宁生. 姜对心脑血管系统的药理作用［J］. 中药新药与临床药理，2003，14（5）：356-360.

Antiparasitic efficacy of 40 Chinese herbal medicines against Ichthyophthirius multifiliis in vitro

WANG Bin，ZHANG Qi-zhong，CHEN Ben-liang，FU Yao-wu
（Institute of Hydrobiology，Jinan University/ Engineering Research Center of Tropical and Subtropical Aquatic Ecological Engineering，Ministry of Education/ Key Laboratory of Aquatic Eutrophication and Control of Harmful Algal Blooms of Guangdong Higher Education Institutes，Guangzhou 510632，China）

The present study investigated the in vitro antiparasitical efficacy of 40 Chinese herbal medicines water extracts againstIchthyophthirius multifiliis. The results showed that the water extracts ofPrunella vulgaris，Agrimonia eupatoria，Panax notoginseng，etc，at the concentration of 50 g/L could kill all trophonts within 4 h，the water extracts ofSophora japonica，Gleditsia sinensis，Llex pubescensand so forth at the concentration of 10 g/L could kill all trophonts，the water extracts ofCercis chinensisandHerba hydrocotylisresulted in 100% mortality of trophonts at the concentration of 1 g/L，the water extract ofZingiber officinaleat the concentration of 0.1 g/L resulted in 100% mortality of trophonts. The water extract ofZ. officinalshowed the highest antiprotozoal efficacy against trophonts and theronts，and the lethal concentrations to trophonts and theronts were 100 and 50 mg/L，respectively. The 4-h median effective concentration （EC50） values of water extract ofZ. officinalto trophonts and theronts were 30.3 mg/L and 15.7 mg/L，respectively. The water extract ofZ. officinal at a concentration of 100 mg/L eliminated the reproduction of all encysted tomonts. The results indicate thatZ. officinalis a potential new drug for the control of ichthyophthiriasis.

Chinese herbal medicine；Zingiber officinale；antiparasitic activity；Ichthyophthirius multifiliis

S852.72

A

1004-874X（2017）07-0147-07

王彬，张其中，陈本亮，等.40种中草药杀灭离体多子小瓜虫效果研究［J］.广东农业科学，2017，44（7）：147-153.

2017-05-11

广东省海洋渔业科技攻关与研发项目（A201501B09）；广州市科技计划项目（201604020040）

王彬（1985-），男，在读博士生， E-mail：jnuniversity@163.com

张其中（1962-），男，博士，教授，E-mail：zhangqzdr@126.com

（责任编辑 崔建勋）