白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡中线粒体差异蛋白鉴定

欧单凤, 陈春霞, 马晓冬, 田雪梅*

(1. 华南师范大学生命科学学院, 广州 510631； 2. 华南师范大学脑科学与康复医学研究院， 广州 510631)

白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡中线粒体差异蛋白鉴定

欧单凤1, 陈春霞1, 马晓冬2, 田雪梅1*

(1. 华南师范大学生命科学学院, 广州 510631； 2. 华南师范大学脑科学与康复医学研究院， 广州 510631)

文中分离提取白藜芦醇处理的HepG2细胞线粒体蛋白质，以未处理HepG2细胞为对照，利用双向电泳技术分离差异蛋白，飞行时间质谱分析鉴定差异蛋白点. 初步分析鉴定了4个显著性差异蛋白，其中驱动蛋白和着丝粒相关蛋白CENP-E在白藜芦醇处理的HepG2细胞中表达降低，证明白藜芦醇对细胞周期有调节作用；线粒体加工肽酶表达降低，线粒体核糖体蛋白L7/L12表达升高，说明白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡与其影响线粒体功能有关.

白藜芦醇； HepG2细胞； 线粒体； 蛋白质组

Keywords： Resveratrol； HepG2 cell； Mitochondria; proteomics

二苯乙烯类物质是植物对抗真菌感染和紫外辐射等逆境生长条件所产生的次生代谢产物，白藜芦醇(Resveratrol)即属于此类物质. 白藜芦醇广泛存在于葡萄、花生、虎杖等多种食用和药用植物中，具有抗氧化、抗炎、抗癌等功效，抑制细胞生长、诱导细胞凋亡是白藜芦醇抗癌的重要机制之一[1-3].

线粒体与细胞的能量代谢和多种功能有关，线粒体功能异常将会启动细胞的应激反应，继而引起基因表达的改变[4]. 线粒体介导的信号转导通路是细胞凋亡的一条重要通路[5]. 作者前期的研究发现白藜芦醇能影响线粒体内膜通道的开放状态[6]. 近期研究发现白藜芦醇能促进结肠癌细胞SW620中线粒体电子传递链超载，导致反应性氧化物(Reactive Oxygen Species，ROS)生成增多，诱导细胞凋亡[7]. 白藜芦醇诱导膀胱癌细胞凋亡也与线粒体功能失调有关[8]. 因此，白藜芦醇的抗癌作用可能与影响肿瘤细胞的代谢有关，通过影响线粒体的功能诱导细胞凋亡可能是白藜芦醇抗癌作用的一种机理.

本研究分离提取人肝癌细胞系HepG2细胞的线粒体蛋白质，采用双向电泳分离线粒体总蛋白，飞行时间质谱进行肽指纹图谱分析鉴定差异蛋白质，分析白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡过程中的线粒体蛋白质的变化，以期发现和认识白藜芦醇诱导人肝癌HepG2细胞凋亡过程中线粒体的潜在作用靶点.

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

白藜芦醇、二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide, DMSO)购自Sigma公司；线粒体提取试剂盒购自Pierce公司；IPG干胶条(3～10NL，17 cm)、IEF Buffer(pH3～10)等双向电泳试剂购自Bio-Rad公司； DMEM培养基为Gibco产品；胎牛血清为杭州四季青公司产品；细胞裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司；其他试剂均为国产分析纯. 酶标仪(Bio-Rad iMark)，等电聚焦仪(Bio-Rad Protean IEF Cell)和垂直电泳仪(Bio-Rad，ProteanⅡ )，质谱仪(ABI 4700 TOF-TOF)， Dounce匀浆器购自上海仕博生物技术有限公司.

1.2 材料

人肝癌细胞系HepG2细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所. 以含10%牛血清的DMEM培养液培养，置于CO2体积分数为5%的细胞培养箱中培养，培养温度37 ℃ . 因线粒体功能异常发生在细胞凋亡过程的较早期，根据前期实验的结果[5]，100 μmol/L白藜芦醇处理24 h是分离线粒体的最佳时间. 因此白藜芦醇处理组为含100 μmol/L白藜芦醇的培养液培养24 h，培养液中DMSO的最终体积分数不超过0.2%；对照组为含体积分数0.2% DMSO的培养液培养24 h.

1.3 线粒体分离

按Pierce线粒体提取试剂盒操作，具体步骤如下：分别收集白藜芦醇处理组和对照组细胞；冰预冷PBS(pH 7.4)洗2次， 10倍体积的线粒体分离缓冲液(20 mmol/L HEPES-KOH，pH7.5，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L DTT，0.25 mol/L 蔗糖，质量分数1% 蛋白酶抑制剂)悬浮细胞，冰上放置10 min；细胞悬液冰浴匀浆，相差显微镜下观察破碎细胞达到75% 以上，于4 ℃、1 000 g离心10 min，取上清液于4℃、1 200 g离心10 min，收集上清，于4 ℃、12 500 g离心20 min，收集沉淀加悬浮缓冲液(10 mmol/L HEPES-NaOH，pH 7.4，0.25 mol/L 蔗糖，1.0 mmol/L MgCl2)离心洗涤2次，即为富含线粒体的粗提物.

1.4 线粒体形态观察

取少量线粒体粗提物进行詹姆斯绿B(Jenu’s Green B)染色，光学显微镜下观察；取适量线粒体粗提物按常规方法制备电镜切片，透射电子显微镜观察线粒体结构.

1.5 线粒体纯化与蛋白质提取

在15 mL离心管中先加入5 mL 1.5 mol/L的蔗糖溶液(含10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 7.5)，然后在液面上轻轻加一层5 mL 1.0 mol/L的蔗糖溶液(含10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，pH 7.5)，形成10 mL的蔗糖浓度梯度溶液. 将线粒体粗提物以1.5 mL悬浮缓冲液悬浮，轻轻加于蔗糖浓度梯度溶液液面上，4 ℃、60 000 g离心30 min，线粒体在1.0 mol/L和1.5 mol/L蔗糖梯度交界处形成薄层，吸出交界处线粒体薄层，用悬浮缓冲液悬浮，4 ℃、20 000 g离心20 min,沉淀线粒体. 线粒体沉淀于细胞裂解液中裂解，获得线粒体蛋白质溶液，用蛋白测定试剂盒(2D Qant kit)测定总蛋白含量，80 ℃保存待用.

1.6 双向电泳分离差异蛋白

双向电泳方法主要参考文献[9]和Bio-Rad仪器操作手册进行.

制样：分别取一定量的线粒体粗提物和纯化的线粒体蛋白质样品，加入已预先加有DTT和IPG缓冲液的Eppendorf管中,再加入相应容积的冲泡胀液，混合好的样品离心除去气泡，为双向电泳样品. 用微量移液器沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品；去除IPG胶条上的保护层，将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上30～45 min，至大部分吸收样品被胶条吸收，然后沿着胶条缓慢加入矿物油，于等电聚焦仪-20 ℃水化11～15 h.

等电聚焦：将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加5 μL超纯水润湿；水化好的胶条沥干矿物油，胶面朝下置于润湿好的滤纸片上杂交，去除表面上的不溶物，面朝下置于聚焦盘中，确保胶条与电极紧密接触，在每根胶条上覆盖2～3 mL矿物油；设置等电聚焦程序，进行等电聚焦.

平衡胶条：将胶条转移至样品水化盘中，加入6 mL平衡缓冲液I，在水平摇床上缓慢摇晃15 min，取出胶条，在滤纸上沥去多余的液体，放入平衡缓冲液II中，继续在水平摇床上缓慢摇晃15 min，取出胶条，用滤纸吸去多余的平衡液.

SDS-PAGE电泳：分离胶的质量分数为12%，平衡后胶条在1倍电泳缓冲液中漂洗数次，胶面朝上，用塑料板将胶条轻轻地推入2块玻璃板间,与分离胶胶面紧密接触，以适量的琼脂糖凝胶封口.

染色：硝酸银和考马斯亮蓝染色.

分析：Umax PowerLook1100光密度仪获取染色后的双向电泳凝胶图像，UV波长为355 nm，重复速率为200 Hz，加速电压为20 000 V，最优质量分辨率为1 500 Da. 扫描质量范围为700～3 200 Da，凝胶图像经Imagemaster 2D platinum 5.0分析软件(Amersham Biosciences)分析，确定差异位点.

1.7 质谱鉴定差异蛋白

切取考马斯亮蓝染色凝胶上的差异蛋白质点，置于1.5 mL EP管. 1 mL纯水清洗蛋白质点3次，每次10 min. 加入脱色液(250 mL乙醇，80 mL冰醋酸，加水至1 000 mL)50 μL浸泡胶片，脱色2 min. 水洗2次，至蛋白质点无色透明后，用体积分数50%的冰醋酸50 μL脱水15 min，50 μL 200 mmol/L 乙醇吸胀5 min，50 μL冰醋酸脱水15 min，真空冷冻干燥1 h，并进行蛋白还原与烷基化，胶内酶内切，提取多肽片段混合物点样，用基质辅助激光解吸P电离飞行时间质谱(MALDI2TOF MS)进行肽质量指纹谱的分析，分析结果利用软件Mascot distiller进行识别. 通过Matrixscience公司的Mascot软件搜索NCBInr数据库(http://www.matrixscience.com)，寻找匹配的相关蛋白质，并通过检索不同的数据库进行蛋白质鉴定与功能预测.

2 结果与分析

2.1 线粒体蛋白质的双向电泳分析

分离后线粒体经透射电镜观察和Jenus Green B染色检测，完整性较好，可用于进一步实验，线粒体粗提物蛋白的双向电泳结果显示，大约有1 100±50个蛋白斑点被检出(图1A)；纯化后的线粒体大约有450±50个蛋白斑点可被检出(图1B). 用白藜芦醇处理细胞的过程中线粒体会受到不同程度的破坏，采用密度梯度纯化的方法纯化线粒体粗体物会导致处理后线粒体丢失，减少差异蛋白，影响蛋白质双向电泳结果，因此，后续实验采用线粒体粗提物进行双向电泳.

图1 线粒体总蛋白质的双向电泳图

2.2 蛋白质组的双向电泳分析

银染的灵敏度高，检测的蛋白点多(图2A、B)，但由于分析型双向电泳上样量少，并且硝酸银染色后蛋白点在质谱鉴定过程中，出峰率低， 因此选用考马斯亮兰染色(图2C、D). 结果显示，处理组和对照组细胞的线粒体中大约有860±60个蛋白点可被检测，初步鉴定出4个差异点(图3)，蛋白的表达体积差异(Vol%)均在150%以上. A、C和D蛋白在白藜芦醇处理组表达下调，而B蛋白在白藜芦醇处理组表达上调.

图2 HepG2细胞线粒体总蛋白质的双向电泳图

图3 不同蛋白的差异表达

2.3 差异蛋白点的质谱鉴定

经过质谱鉴定(表1)，4个差异蛋白分别是：驱动蛋白(蛋白点A)、线粒体核糖体蛋白L7/L12(蛋白点B)、着丝粒相关蛋白CENP-E(蛋白点C)、线粒体加工肽酶(蛋白点D).

表1 差异蛋白鉴定结果和功能Table 1 Identification and function of the differentially expressed proteins

3 讨论

线粒体是细胞能量代谢、生物合成和细胞死亡的调控中心，其功能异常会导致肿瘤、代谢性疾病、神经退行性病变等许多疾病的发生[10-12]. 线粒体蛋白表达异常是线粒体功能异常的重要原因，通过线粒体蛋白质组学可系统研究正常和病变组织中线粒体蛋白表达的差异，从而揭示研究线粒体相关疾病的分子机制以及药物的作用的可能途径[13].

分离提取线粒体蛋白质是进行线粒体蛋白质组学研究的关键步骤，由于药物作用会导致线粒体不同程度的损伤，经过比较线粒体粗提物和纯化的线粒体蛋白质双向电泳的结果，选择利用线粒体粗提物进行线粒体蛋白质组的差异分析. 白藜芦醇处理后4种蛋白质表达明显发生差异，其中驱动蛋白和着丝粒相关蛋白CENP-E 2种着丝粒蛋白是参与细胞周期的蛋白质，其表达下降说明白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡可能与2种着丝粒蛋白的表达抑制有关，与白藜芦醇影响细胞周期的功能相一致[1-2]. 线粒体中的蛋白质大部分来自于细胞核DNA编码的蛋白，驱动蛋白和丝粒相关蛋白即属于核编码的蛋白，它们是否与线粒体的功能也有关还需进一步研究.线粒体加工肽酶的表达变化说明白藜芦醇影响线粒体的功能活动.

核糖体蛋白是组成核糖体的主要成分,在核糖体组装和蛋白质合成中起重要作用，近年来研究[14]发现核糖体蛋白还具有广泛的核糖体外功能,在细胞生长、增殖、凋亡以及一些病理过程中发挥重要作用. 线粒体核糖体蛋白作为线粒体核糖体的组成部分，其发生缺失或突变也会影响线粒体蛋白的合成而可能导致线粒体疾病[15]. 本研究中发现线粒体核糖体蛋白的表达上调，说明白藜芦醇诱导HepG2细胞凋亡过程中线粒体核糖体蛋白可能为其作用靶点，影响线粒体功能，进而影响细胞凋亡，其机制尚有待深入研究.

[1] BHAT K P,PEZZUTO J M. Cancer chemopreventive activity of resveratrol [J]. Annual of the New York Academy of Sciences,2002,957(5):210-229.

[2] VARONI E M, LO FARO A F,SHARIFI-RAD J,et al. Anticancer molecular mechanisms of resveratrol [J]. Frontiers Nutrition,2016,8(3):1-15.

[3] ALUYEN J K,TON Q N,TRAN T,et al. Resveratrol:potential as anticancer agent [J]. Journal of Dietary Supplements,2012,9(1):45-56.

[4] RICHTER-DENNERLEIN R,OELJEKLAUS S,LORENZI I,et al. Mitochondrial protein synthesis adapts to influx of nuclear-encoded protein [J]. Cell,2016,167(2):471-483.

[5] WANG C,YOULE R J. The role of mitochondria in apoptosis [J]. Annual Review of Genetics,2009,43(1):95-118.

[6] MA X D,TIAN X M,HUANG X,et al. Resveratrol-induced mitochondrial dysfunction and apoptosis are associated with Ca2+and mCICR-mediated MPT activation in HepG2 cells [J]. Molecular and Cellular Biochemistry,2007,302(1/2):99-109.

[7] BLANQUER-ROSSELLO M D,HEMANDEZ-LOPEZ R,ROCA P,et al. Resveratrol induces mitochondrial respiration and apoptosis in SW620 colon cancer cells [J]. Biochimica et Biophysica Acta,2017,1861(2):431.

[8] LIN X,WU G,HUO W Q,et al. Resveratrol induces apoptosis associated with mitochondrial dysfunction in bladder carcinoma cells [J]. International Journal of Urology,2012,19(5):757-764.

[9] RICHARD E,MONTEOLIVA L,JUAREZ S,et al. Quantitative analysis of mitochondrial protein expression in methylmalonic acidemia by two-dimensional difference gel electrophoresis [J]. Journal of Proteome Research,2006,5(7):1602-1610.

[10] OLIVEIRA M R,NABAVI S F,MANAYI A,et al. Resveratrol and the mitochondria:from triggering the intrinsic apoptotic pathway to inducing mitochondrial biogenesis,a mechanistic view [J]. Biochimica et Biophysica Acta ,2016,1860(4):727-745.

[11] ROGALINSKA M. The role of mitochondria in cancer induction,progression and changes in metabolism [J]. Mini Reviews in Medicinal Chemistry,2016,16(7):524-530.

[12] WANG X,PERALTA S,MORAES C T. Mitochondrial alterations during carcinogenesis:a review of metabolic transformation and targets for anticancer treatments [J]. Advances in Cancer Research,2013,119(1):127-160.

[13] GREGERSEN N,HANSEN J,PALMFELDT J. Mitochondrial proteomics:a tool for the study of metabolic disorders [J]. Journal of Inherited Metabolic Disease,2012,35(4):715-726.

[14] WANG W,NAG S,ZHANG X,et al. Ribosomal proteins and human diseases:pathogenesis,molecular mechanisms,and therapeutic implications [J]. Medicinal Research Reviews,2015,35(2):225-285.

[15] LEE J,SEOl M Y,JEONG S,et al. A metabolic phenotype based on mitochondrial ribosomal protein expression as a predictor of lymph node metastasis in Papillary Thyroid [J]. Carcinoma，2015,94(2):1-8.

Analysis of Mitochondrial Proteome in Apoptosis of HepG2 Cells Induced by Resveratrol

OU Shanfeng1， CHEN Chunxia1, MA Xiaodong2, TIAN Xuemei1*

(1.School of Life Sciences, South China Normal University, Guangzhou 510631, China; 2. Institute for Brain Research and Rehabilitation (IBRR), South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

The effects of resveratrol on HepG2 cells apoptosis were investigated. Mitochondrial proteins were extracted from control and resveratrol treated cells and separated by two-dimensional electrophoresis. The peptide mass finger-printing was analyzed by time-of flight mass spectrometer. Four significantly differentiated proteins were identified. Kinesin protein and centromere-associated protein E (CENP-E) were down-regulated in HepG2 cells treated with resveratrol, which testified function of resveratrol on cell cycle regulation. Down-regulation of mitochondrial processing peptidase and up-regulation of mitochondrial ribosomal protein L7/L12 in HepG2 cells treated with resveratrol suggested the relationship between apoptosis induced by resveratrol and mitochondrial dysfunction in HepG2 cells.

2016-12-14 《华南师范大学学报(自然科学版)》网址：http://journal.scnu.edu.cn/n

国家自然科学基金项目(30300455)；广东省科技计划项目(2014A020212504)

*通讯作者:田雪梅，教授，Email:xmtian69@163.com.

R329.2

A

1000-5463(2017)05-0059-04

【中文责编：成文 编辑助理：冷佳奕 英文审校：李海航】