microRNA-181c在重症肌无力患者外周血单个核细胞中的表达及其意义

郭明凤， 陈 政， 赵红梅， 董瑞国， 张 勇， 孙 虹

microRNA-181c在重症肌无力患者外周血单个核细胞中的表达及其意义

郭明凤1， 陈 政1， 赵红梅1， 董瑞国2， 张 勇2， 孙 虹1

目的探讨microRNA-181c(miR-181c)在重症肌无力(myasthenia gravis，MG)患者中的表达水平及其临床意义。方法收集2015年6月-2017年6月收治的22例MG患者和20例健康人的外周静脉血样，提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中总RNA，采用实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)技术检测PBMC中miR-181c的相对表达水平，并分析miR-181c表达水平与患者的MG定量评分体系(quantitative myasthenia gravis score，QMG)的相关性。结果MG患者PBMC中miR-181c的相对表达水平(0.303±0.150)较对照组(1.000±0.262)显著降低(P<0.01)，其中全身型患者(0.182±0.056)低于眼肌型患者(0.404±0.126)(P<0.05)，同时miR-181c表达水平与QMG呈负相关(R2=-0.359，P<0.05)。结论MG患者PBMC中miR-181c表达水平的降低可能与病情严重程度有关。

重症肌无力； 人外周血单个核细胞； miR-181c

MG是一种由乙酰胆碱受体抗体(acetylcholine receptor antibody，AChR-Ab)介导、细胞免疫依赖、补体参与、累及神经肌肉接头突触后膜、引起神经肌肉接头传递障碍、出现骨骼肌收缩无力的获得性自身免疫性疾病。MG主要临床表现为骨骼肌无力、易疲劳、活动后加重，休息和应用胆碱酯酶抑制剂后症状明显缓解[1]。但其确切发病机制目前仍尚不明确。microRNA作为广泛存在于生物体内的高度保守的短小RNA，在调控细胞增殖、分化、凋亡及免疫、炎症反应等多种生物学功能中发挥重要作用[2～4]。近年来关于miR-181c的研究发现，其在肿瘤的发生发展及自身免疫性疾病中可能起到关键作用[5～7]。因此我们以miR-181c为研究对象，通过检测其在MG患者PBMC中的相对表达水平来探讨其临床意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 收集2015年6月-2017年6月南京医科大学附属淮安第一医院收治的22例MG患者(包括眼肌型12例，全身型10例)，同时以20例健康体检者作为对照组。实验组纳入标准：根据临床症状、疲劳试验、新斯的明试验、神经电生理检查或相关血清抗体的检测确诊为重症肌无力的患者，且就诊前3 m内未使用过激素或免疫抑制剂；不伴其他自身免疫性或炎性疾病；女性患者处于非妊娠、非哺乳期。对照组纳入标准：体检各项指标正常；3 m内未使用过激素或免疫抑制剂，无自身免疫性或炎性疾病的健康人。根据患者症状采用QMG评分表分别进行评分。分别对两组(MG组与健康对照组；眼肌型与全身型)年龄进行t检验、性别构成比进行χ2检验，两组研究对象在年龄、性别构成比方面均无显著性差异(P>0.05)，具有可比性(见表1)。

1.1.2 主要试剂及仪器 淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；SYBR Green Realtime RT 试剂盒、SYBR Green Realtime PCR试剂盒(上海艾博思生物科技有限公司)；Roche LightCycler 480 PCR仪(罗氏公司)。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及cDNA提取 所有受试者空腹采血，采用Ficoll分层液法分离得到PBMC，Trizol 法提取PMBC中总RNA，进行RNA纯度及完整性测定(见图1)。以上述RNA为模板制备cDNA，所得cDNA-20 ℃保存作为PCR反应模板。

1.2.2 检测PBMC中miR-181c的相对表达水平 以cDNA为模板，按说明书建立PCR反应体系后上PCR仪器检测，PCR循环参数设定：95 ℃，预变性，3min；变性，95 ℃，15 s；退火延伸，60 ℃，40 s；共45个循环，作融解曲线及扩增曲线(见图2、图3)验证扩增产物的特异性，反应完成后设定基线值(Baseline)和阈值(Threshold)，读取阈循环(Ct)值。根据公式[8]ΔCt =[Ct (目的基因miR-181c )]-[Ct (内参基因U6)]和ΔΔ Ct =[ Δ Ct (研究组)]-[ Δ Ct (对照组)]，计算出相对表达量 =2 -ΔΔCt 。

2 结 果

2.1 研究发现 MG组PBMC中miR-181c的相对表达水平(0.303±0.150)显著低于健康对照组(1.000±0.262)(见图4A)，差异具有统计学意义(★★P<0.01)，其中全身型亚组表达水平(0.182±0.056)低于眼肌型亚组(0.404±0.126)(见图4B)，差异具有统计学意义(▲P<0.05)。

2.2 在研究重症肌无力组PBMC中miR-181c的表达量与患者的QMG相关性显示 MG组的表达水平与QMG呈负相关性，R2=-0.359，P<0.05，具有统计学意义(见图5)。

表1 重症肌无力组患者与健康对照组一般资料比较

图1 RNA电泳条带图

图2 miR-181c 溶解曲线及扩增曲线

图3 U6溶解曲线及扩增曲线

图4 MG组与健康对照组PBMC中miR-181c的表达水平(A)；眼肌型亚组与全身型亚组PBMC中miR-181c的表达水平(B)(★★P<0.01，▲P<0.05)

miR-181c相对表达量

图5 外周血单个核细胞中miR-181c相对表达量与QMG呈负相关(P<0.05)

3 讨 论

microRNA在控制和调节免疫方面的研究已日渐增多，近期有研究报道[9]，对实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)模型大鼠外周血淋巴细胞差异表达的miRNAs进行筛选，发现有11个miRNAs 表达差异显著：其中8 个miRNAs 表达下调(miR-24、miR-151、miR-423、miR-181c、miR-145、miR-326、miR-143和miR-328a)；3 个miRNAs表达上调(miR-101a、miR-193和miR-33)，而miR-181c就是其中表达的下调基因。

miR-181c作为miR-181家族成员，位于第19号染色体正链，其基因组结构在进化上非常保守，含有共同的5’端“种子”序列-ACAUUCA。Xue等[10]报道了在原始T细胞和活化CD4+T细胞中筛选鉴定差异表达的miRNAs时，发现miR-181c 有调控CD4+T淋巴细胞活化的潜力，进一步的体外实验证实miR-181c 表达水平在T细胞活化过程中降低，转染miR-181c模拟物可以部分抑制T细胞的活化，从而证实了miR-181c对CD4+T细胞的负调控作用。目前越来越多的研究发现miR-181c在多种肿瘤中表达异常，包括胶质母细胞瘤、卵巢癌、胰腺癌等。He[11]等发现可以通过miR-181c过表达，下调TGFBR1、TGFBR2和TGFBRAP1表达水平，抑制TGF-β信号传导，从而在胶质母细胞瘤细胞侵袭、迁移和间质转化中起到关键作用。Yao[12]等研究报道miR-181c通过与3’-UTR结合靶向调节PRKCD的表达，从而使A2780细胞的增殖和转移减少，来抑制卵巢癌转移和进展。Chen[13]等研究发现miR-181c可以直接抑制人胰腺癌细胞中的MST、LATS2、MOB1和SAV1的表达；miR-181c的过度表达诱导YAP/TAZ的高活化并增强Hippo信号传导下游基因CTGF，BIRC5和BLC2L1的表达，导致体外和体内胰腺癌细胞存活和化学耐药的发生。

目前miR-181c在自身免疫性疾病中的报道较为少见。Haghikia 等[7]研究发现，与复发-缓解型多发性硬化患者(relapsing-remitting MS，RRMS)相比，继发进展型多发性硬化患者(secondary progressive MS，SPMS)脑脊液(cerebrospinal fluid，CSF)中miR-181c表达水平降低。Abdelsadik A[14]的研究发现Toll样受体(TLR)这一类受体家族，其通过宿主的先天免疫系统识别入侵病原体的存在，而不恰当的TLR信号传导可导致自身免疫疾病的发生。而另外一项研究发现miR-181c-TLR4通路在缺氧小胶质细胞激活和神经元激活中起到重要作用，miR-181c通过与其3’-UTR结合抑制TLR4的表达，从而抑制NF-κB的活化和下游促炎性介质的产生[15]。上述研究均提示miR-181c可能在神经免疫疾病中具有重要意义。本研究发现MG患者外周血单个核细胞中miR-181c的相对表达水平显著低于对照组，且全身型低于眼肌型。同时miR-181c的表达水平与QMG呈负相关，提示其表达水平的降低可能与病情严重程度有关。由于本研究时间有限，收集病例数相对较少，还需扩大样本量，进一步深入探究miR-181c在MG中具体可能的作用机制。

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ExpressionofmicroRNA-181cinperipheralbloodmononuclearcellsfrompatientswithmyastheniagravisanditssignificance

GUOMingfeng,CHENZheng,ZHAOHongmei,etal.

(DepartmentofEmergencyMedicine，Huai’anFirstPeople’sHospital，NanjingMedicalUniversity，Huai’an223300,China)

ObjectiveTo evaluate the expression and clinical significance of miR-181c in patients with myasthenia gravis.MethodsPlasma blood samples from 22 patients with MG and 20 healthy subjects were collected from June 2015 to June 2017，and the total RNA was extracted from peripheral blood mononuclear cells.To detect the relative expression of miR-181c in PBMC by Real-time quantitative polymerase chain reaction and to analyze the correlation between the expression level of miR-181c and the quantitative myasthenia gravis score (QMG) in MG patients.ResultsThe relative expression level of miR-181c in PBMC of MG patients (0.303±0.150) was significantly lower than that of control group (1.000±0.262) (P<0.01),and the level of miR-181c in generalized patients (0.182±0.056) was lower than that in ocular patients (0.404±0.126) (P<0.05),meanwhile the expression level of miR-181c was negatively correlated with QMG (R2=-0.359，P<0.05).ConclusionThe decrease of miR-181c expression in PBMC of MG patients may be related to the severity of the disease.

Myasthenia gravis； PBMC； miR-181c

R746.1

A

1003-2754(2017)10-0916-03

2017-08-12；

2017-10-03

(1.南京医科大学附属淮安第一医院急诊科，江苏 淮安 223300；2.徐州医科大学附属医院神经内科，江苏 徐州 221000)

孙 虹，E-mail：hayyzb@126.com