基于银纳米粒子催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系测定丹参酮ⅡA磺酸钠

张多多，宗 晨，王淑美，李 萍*

(1.广东药科大学 中药学院，广东 广州 510006；2.中国药科大学 天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京 210009)

基于银纳米粒子催化鲁米诺-过氧化氢化学发光体系测定丹参酮ⅡA磺酸钠

张多多1,2，宗 晨2，王淑美1，李 萍1,2*

(1.广东药科大学 中药学院，广东 广州 510006；2.中国药科大学 天然药物活性组分与药效国家重点实验室，江苏 南京 210009)

碱性条件下，丹参酮ⅡA磺酸钠能够抑制鲁米诺-过氧化氢-银纳米粒子的化学发光，据此建立了测定丹参酮ⅡA磺酸钠的化学发光分析方法。通过优化发光底物浓度、反应介质及其浓度和银纳米粒子浓度等因素，确立了最佳实验条件，并探讨了体系的可能机理。在5.0×10-6～0.08 mol/L浓度范围内，体系的化学发光强度与丹参酮ⅡA磺酸钠浓度的对数值呈线性关系，检出限为9.38×10-7mol/L，检测时间为20 s。该方法灵敏度好，检测范围宽，可简单快速地测定注射液中丹参酮ⅡA磺酸钠的含量，检测结果与高效液相色谱法的测定结果较为一致。

化学发光；银纳米粒子；鲁米诺；丹参酮ⅡA磺酸钠

丹参酮ⅡA磺酸钠(结构式见图1)具有抗心肌缺血再灌注损伤、抗动脉粥样硬化、缩小心肌梗死面积、降低心肌耗氧量等作用，临床上广泛用于心绞痛、心肌梗死、冠心病及室性早搏等心血管疾病的治疗[1-2]。因此，建立简单、准确、灵敏的丹参酮ⅡA磺酸钠检测新方法，对于其相关产品(如注射液)的生产及质量控制十分重要。目前，丹参酮ⅡA磺酸钠含量的测定方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[3-6]、核磁共振法[7]等，但这些方法存在成本高、操作繁琐、检测试剂量大等不足。

图1 化学发光法测定丹参酮ⅡA磺酸钠的示意图Fig.1 Schematic diagram of chemiluminescence assay of sodium tanshinon ⅡA sulfonate

化学发光(CL)是物质在化学反应过程中伴随的一种光辐射现象。CL分析法根据化学发光强度检测待测物质含量，具有仪器操作简单、线性范围宽、分析快速等优点[8-9]。近年来，纳米材料的出现促进了化学发光分析法的迅速发展[10-19]，由于纳米粒子尺寸小、比表面积大，具有异于常规粒子的表面活性、光催化性等物理化学特性[13]，可将之作为化学发光的催化剂引入体系，从而显著提高化学发光分析法的灵敏度。目前研究较多的是金纳米粒子[10-16]，而银纳米粒子具有更低的氧化还原电势，催化能力更强[8]，近年来基于银纳米粒子催化的化学发光体系也得到了应用[17-19]。

本实验发现，碱性条件下丹参酮ⅡA磺酸钠对鲁米诺-过氧化氢-银纳米粒子化学发光体系具有较强的抑制作用(如图1所示)，而采用化学发光法测定丹参酮ⅡA磺酸钠的文献尚未见报道。据此，本文建立了测定丹参酮ⅡA磺酸钠的化学发光分析法，并将其应用于丹参酮ⅡA磺酸钠注射液中丹参酮ⅡA磺酸钠含量的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

BPCL微弱化学发光分析仪(北京亚泊斯科技有限公司)，G-560E涡旋混合器/旋涡振荡器(美国Scientific Industries公司)，5427 R高速低温离心机(Eppendorf公司)，85-1磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)，BT 25S和BT 224S分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)，LC-20A(PDA)型分析液相色谱-DAD(日本岛津公司)，JEM-200CX型透射电子显微镜(日本JEOL公司)，Nano-100微量紫外分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司)，Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

鲁米诺(Luminol)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，配成0.01 mol/L luminol标准储备液：称取17.71 mg luminol，用1 mL 1.0 mol/L NaOH溶解，并加水定容至10 mL，室温下避光保存。30%过氧化氢(H2O2)溶液、AgNO3、NaOH、Na2CO3、NaBH4购自南京化学试剂有限公司，NaHCO3购自上海凌峰化学试剂有限公司，柠檬酸三钠购自国药集团化学试剂有限公司。丹参酮ⅡA磺酸钠对照品(批号：MUST-17022603)由成都曼思特生物科技有限公司和中国科学院成都生物研究所研制，丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(诺新康，批号：1603112)购自上海上药第一生化药业有限公司。实验所用试剂均为分析纯，实验用水为Milli-Q超纯水。

1.2 实验方法

首先，依据常规方法合成银纳米粒子(AgNPs)[20]：先配制0.25 mmol/L AgNO3和0.25 mmol/L 柠檬酸三钠的混合溶液200 mL，再在冰浴中配制10 mmol/L NaBH4，取6 mL逐滴加入AgNO3-柠檬酸三钠混合溶液中，搅拌反应30 min至溶液呈黄色胶体状，说明AgNPs已制备成功，放入4 ℃冰箱避光冷藏待用。

为得到丹参酮ⅡA磺酸钠的标准曲线，将对照品用超纯水稀释至不同浓度，分别取4 μL，与同体积NaOH、AgNPs、luminol和H2O2在200 μL EP管中混合，置于BPCL微弱化学发光分析仪的样品池中，以光电倍增管在961 V高压下进行静态检测，检测时间为20 s。

2 结果与讨论

2.1 化学发光光谱

分别使用350、420、480、540、600、650 nm滤光片，研究了luminol-H2O2、luminol-H2O2-AgNPs、luminol-H2O2-AgNPs-丹参酮ⅡA磺酸钠3个体系的化学发光随波长变化的谱图，发现其最大发射波长均在425 nm左右(图2)，表明3个体系的发光体均为激发态3-氨基邻苯二甲酸[8,18]。

图2 Luminol-H2O2(a)、luminol-H2O2-AgNPs(b)、luminol-H2O2-AgNPs-丹参酮ⅡA磺酸钠(c)的化学发光光谱Fig.2 CL spectra of luminol-H2O2(a),luminol-H2O2-AgNPs(b)and luminol-H2O2-AgNPs-sodium tanshinon ⅡA sulfonate(c)conditions:0.625 mmol/L NaOH,2.5×10-3 mol/L luminol,1.25 mol/L H2O2,3.0×10-8 mol/L AgNPs,1.0×10-3 mol/L sodium tanshinon ⅡA sulfonate

2.2 实验条件的优化

2.2.1反应介质及其浓度优化分别比较luminol-H2O2-AgNPs体系在NaOH、Na2CO3和Na2CO3-NaHCO33种碱性介质中的化学发光强度，发现该体系在NaOH中化学发光强度最大。在0.5～12.5 mmol/L范围内考察了NaOH浓度对化学发光强度的影响，结果表明，化学发光强度随着NaOH浓度增大而增大，当浓度为0.625 mmol/L时，体系的发光强度达到最大，浓度大于0.625 mmol/L时体系的发光强度反而下降，故选择0.625 mmol/L为NaOH的最优浓度。

2.2.2Luminol浓度优化在2.5×10-5～0.01 mol/L范围内考察了luminol浓度对化学发光强度的影响，结果表明，化学发光强度随着luminol浓度增大而增大，当浓度为2.5×10-3mol/L时，体系的发光强度达到最大，浓度大于2.5×10-3mol/L时体系的发光强度反而下降，故选择2.5×10-3mol/L为luminol的最优浓度。

2.2.3H2O2浓度优化在0.01～10 mol/L范围内考察了H2O2浓度对化学发光强度的影响，发现化学发光强度随着H2O2浓度增大而增大，当浓度为1.25 mol/L时，体系的发光强度达到最大，当浓度大于1.25 mol/L时，化学发光强度反而下降，故选择1.25 mol/L为H2O2的最优浓度。

2.2.4AgNPs浓度优化在7.5×10-10～3.0×10-8mol/L范围内考察了AgNPs浓度对化学发光强度的影响，发现化学发光强度随着AgNPs浓度增大而增大，因此AgNPs的最优浓度为3.0×10-8mol/L。

2.3 工作曲线、精密度和检出限

在优化实验条件下，考察了luminol-H2O2-AgNPs-丹参酮ⅡA磺酸钠的化学发光随时间的变化，结果显示，luminol-H2O2体系本身化学发光并不强，随着AgNPs的加入，化学发光强度明显增大，而丹参酮ⅡA磺酸钠则对luminol-H2O2-AgNPs的化学发光强度具有明显的抑制作用，并且随着丹参酮ⅡA磺酸钠浓度的增加而逐渐降低。

在最佳实验条件下，当丹参酮ⅡA磺酸钠浓度在5.0×10-6～0.08 mol/L范围内，化学发光强度(Y)与其浓度(X，mol/L)对数值呈良好的线性关系，线性方程为Y=-4.14×105-3.78×105lgX，r2=0.999 9，检出限(LOD)为9.38×10-7mol/L。

对8.0×10-4mol/L丹参酮ⅡA磺酸钠标准溶液平行测定9次，相对标准偏差(RSD)为2.0%，说明该方法精密度良好。

2.4 干扰试验

在最佳实验条件下，当丹参酮ⅡA磺酸钠浓度为1.0×10-3mol/L，800倍的葡萄糖，200倍的Na+，100倍的K+、NO3-、F-、SO42-，相同浓度的Mg2+、Ca2+、原儿茶酸、紫草酸、盐酸川芎嗪均不干扰测定，表明该方法具有很好的选择性。

2.5 机理探讨

2.5.1银纳米粒子的表征利用透射电子显微镜(Transmission electron microscope，TEM)对制备好的AgNPs进行表征，得到其外观和尺寸：所制AgNPs均为球形，平均直径约为6 nm(图3A)；其紫外可见光谱在390 nm处出现最大吸收峰(图3B)，与文献中合成的银纳米粒子的紫外吸收峰大致相同[20]。

2.5.2化学发光动力学曲线考察了luminol-H2O2、luminol-H2O2-AgNPs和luminol-H2O2-AgNPs-丹参酮ⅡA磺酸钠的化学发光动力学曲线，结果表明，3种体系的化学发光值均迅速上升，分别在8.4、7.2、8.4 s左右达到最大值后缓慢下降，说明AgNPs的引入加快了化学发光反应，而丹参酮ⅡA磺酸钠的存在会延缓这一进程。

图4 银纳米粒子催化化学发光的可能机理Fig.4 Possible mechanism of CL reaction catalyzed by AgNPs

2.5.3可能的机理根据以往纳米粒子增强化学发光的报道，结合化学发光最大波长、动力学曲线可以推知，本研究中，AgNPs是luminol-H2O2体系的催化剂，可能的机理如图4所示：AgNPs催化H2O2分解生成羟基自由基[21-22]，羟基自由基与鲁米诺阴离子反应，生成鲁米诺自由基和超氧阴离子，继而产生化学发光。向luminol-H2O2-AgNPs体系内加入抗坏血酸，化学发光抑制了95.4%，证实了羟基自由基的存在及作用。一方面，AgNPs能够加快电子转移过程并促进自由基生成，另一方面，羟基自由基可以稳定在AgNPs表面，使大量的3-氨基邻苯二甲酸激发态在银纳米粒子表面生成，降低了激发态与溶剂分子的碰撞几率。两方面协同作用，大大增强了化学发光强度[23-24]。

2.6 分析应用

在线性范围内，将丹参酮ⅡA磺酸钠注射液(标示量5 mg/mL)分别稀释5、10、20倍作为3种实际分析样品(分别记为样品1、2、3)。在最佳实验条件下，按本方法测定3种样品中丹参酮 Ⅱ A磺酸钠的浓度并进行加标回收实验。结果表明：方法的回收率为99.2%～102%，RSD(n=6)为1.1%～2.4%，与HPLC的测定结果进行对比，相对误差绝对值≤3.64%(见表1)，表明该方法准确可靠，实用性良好。

表1 实际样品分析及加标回收实验结果Table 1 Assay and recovery results of sodium tanshinon ⅡA sulfonate in analytical samples

3 结 论

本文利用碱性条件下丹参酮ⅡA磺酸钠对鲁米诺-过氧化氢-银纳米粒子化学发光体系的抑制作用，首次建立了测定丹参酮ⅡA磺酸钠的化学发光分析方法。与其它方法比较，本方法操作简单、检测时间短(20 s)、检测范围宽(5.0×10-6～0.08 mol/L)、检出限低(9.38×10-7mol/L)、消耗样品量少(4 μL)。该法应用于丹参酮ⅡA磺酸钠注射液中丹参酮ⅡA磺酸钠的含量测定，结果准确，在药物分析、质量控制中具有应用前景。

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Detection of Sodium Tanshinon ⅡA Sulfonate Based on Silver Nanoparticles-Luminol-H2O2Chemiluminescence System

ZHANG Duo-duo1,2,ZONG Chen2,WANG Shu-mei1,LI Ping1,2*

(1.College of Traditional Chinese Medicine,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China;2.State Key Laboratory of Natural Medicines,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)

A novel method for the detection of sodium tanshinon ⅡA sulfonate was developed based on the inhibition effect of sodium tanshinon ⅡA sulfonate on luminol-H2O2-silver nanoparticles(AgNPs)chemiluminescence(CL) under alkaline condition.The optimal experiment conditions were established by optimizing the concentration of CL substrates,reaction medium and its concentration,and the concentration of AgNPs.The possible mechanism of the CL system was also investigated.Under the optimal conditions,the CL intensity was inversely proportional to logarithm value of sodium tanshinon ⅡA sulfonate concentration in the range of 5.0×10-6-0.08 mol/L with a detection limit of 9.38×10-7mol/L and a detection time of 20 s.With a considerable sensitivity and a wide detection range,the proposed method could be applied in the simple and fast detection of sodium tanshinon ⅡA sulfonate in the injection solution with satisfactory results which are in good agreement with the reference values obtained by high performance liquid chromatography.

chemiluminescence;silver nanoparticles;luminol;sodium tanshinon ⅡA sulfonate

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.10.014

O657.3；R917

A

1004-4957(2017)10-1245-05

2017-06-22；

2017-07-12

国家自然科学基金青年基金(21505160)

*

李 萍，博士，教授，研究方向：中药药效物质基础与质量控制，Tel：025-83271379，E-mail：liping2004@126.com