新型固相微萃取涂层材料的制备及其在迷迭香挥发性成分检测分析中的应用

何 静，李 涛，董美玉，董 南

(贵州大学 化学与化工学院，贵州 贵阳 550025)

新型固相微萃取涂层材料的制备及其在迷迭香挥发性成分检测分析中的应用

何 静，李 涛，董美玉，董 南*

(贵州大学 化学与化工学院，贵州 贵阳 550025)

利用溶胶-凝胶法制备了含全羟基取代五元瓜环(Q[5])的新型固相微萃取涂层。以全羟基取代五元瓜环(Q[5](OH)10)和端羟基聚二甲基硅氧烷(OH-PDMS)为起始原料，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH-560)为偶联试剂，通过水解和缩合反应制备了 PDMS/Q[5](OH)10新型涂层。采用扫描电镜、傅立叶红外光谱、差示扫描量热分析和热重分析分别对涂层组织形貌、结构特点以及热稳定性进行了检测。结果表明该涂层具有较大的表面积，良好的热稳定性(360 ℃)和较长的使用寿命。将该涂层制备成固相微萃取纤维，联用气相色谱-质谱技术对迷迭香的挥发性成分进行了分析，并用面积归一法测定其相对含量。优化的萃取条件为：萃取温度80 ℃，萃取时间45 min,样品质量0.200 0 g。在此条件下，鉴定出迷迭香中的25种挥发性成分，含量较高的成分为1,8-桉叶素、樟脑和α-蒎烯。将自制纤维与商用纤维(PDMS/DVB/CAR)的萃取效果进行了对比，从萃取成分的数量和含量来看，自制纤维的萃取效果和商用纤维相当，说明自制的固相微萃取纤维可用于植物中挥发性成分的快速检测分析。

溶胶-凝胶技术；固相微萃取涂层；全羟基取代五元瓜环；气相色谱-质谱；迷迭香

迷迭香为唇形科植物迷迭香RosmarinusofficinalisL.(ROL)的全草，原产南欧各国。迷迭香挥发油对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、霍乱弧菌等有抗菌作用，效力中等[1]。 迷迭香挥发油的提取一般采用水蒸气蒸馏结合溶剂萃取法[2]、超临界CO2萃取法[3]等,分析检测主要采用气相色谱-质谱联用技术[4-5]。采用传统方法提取时，样品用量多，操作复杂，过程损失较大，且需使用有机溶剂。

固相微萃取(SPME)技术是一种新颖的样品前处理技术。该技术由加拿大Waterloo大学的Pawliszyn教授于1989年最先提出[6]，美国Supelco公司于1993年将其商品化。SPME集采样、萃取、浓缩、进样于一体，具有简便、快速、便携、高效、无需有机溶剂及易与气相色谱、高效液相色谱、气相色谱-质谱联用、毛细管电泳等分析仪器联用的优点。因此，在环境分析[7-8]、食品分析[9]、药物分析[10-11]、生物样品分析[12]等领域得到了广泛的应用。SPME目前已商品化的涂层有聚二甲基硅氧烷、聚丙烯酸酯、聚二甲基硅氧烷/二乙烯基苯和聚二甲基硅氧烷/羧乙基等。商品涂层是将吸附材料直接涂覆在石英纤维载体上，其稳定性和选择性较差，推荐使用温度普遍偏低(200～280 ℃)，使用寿命短(一般约为40～100次)，价格昂贵，因而大大限制了其应用。随着分析样品的增多，尤其是对复杂基体中样品检测需求的扩大，开发高选择性、高效的固相涂层材料成为SPME研究的重要方向。

瓜环是一类由亚甲基桥联苷脲单元形成的新型大环化合物，从结构来看，其内部疏水性的空腔结构可通过疏水作用与小分子发生包结作用，同时其空腔两端口环绕的多个羰基可通过离子-偶极、氢键作用与极性分子发生主客体相互作用[13-14]，因此瓜环是一类分子识别能力较强的大环主体化合物。本文利用瓜环的分子识别能力，将普通五元瓜环(Q[5])衍生化为全羟基取代五元瓜环(Q[5](OH)10)后，以γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH-560)为偶联剂，通过溶胶-凝胶方法和自由基交联技术，将瓜环化学键合在溶胶-凝胶涂层上，制备出含五元瓜环的新型固相微萃取涂层。将此涂层制备成固相微萃取纤维，并结合气相色谱-质谱技术对中药迷迭香的挥发性组分进行分析，取得了满意的结果。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

迷迭香干叶2015年购于贵阳市宏盛药店，经贵州省中医大学陈德媛研究员鉴定为迷迭香；迷迭香干叶经粉碎过100目筛备用。三氟乙酸(TFA)、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH-560)、正硅酸乙酯(TEOS)、端羟基聚二甲基硅氧烷(OH-PDMS)、含氢硅油(PMHS)均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。固相微萃取装置：SPME手柄及50/30 μm PDMS/DVB/CAR StableFlex 萃取头购自美国Supelco 公司。HP4890D气相色谱仪、HP6890/5974C气相色谱-质谱联用仪(美国安捷伦公司)；X-650 扫描电镜(日本Hitachi公司)；VERTEX70 傅立叶红外光谱仪(德国Bruker公司)；Netzsch Sta 449C 热分析仪(德国Netzsch 公司)。

1.2 溶胶-凝胶涂层(PDMS/Q[5](OH)10)的制备

取10 mL聚氯乙烯离心管依次加入全羟基取代五元瓜环(Q[5](OH)1020 mg，二氯甲烷(CH2Cl2)700 μL，端羟基聚二甲基硅氧烷(OH-PDMS)150 μL，含氢硅油(PMHS)30 μL，正硅酸乙酯(TEOS)250 μL，γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(KH-560)250 μL，振荡混匀，再加入95%的三氟乙酸(TFA) 600 μL振荡3 min，并以12 000 r·min-1离心5 min，取上层清液作为溶胶-凝胶涂层。

1.3 自制固相微萃取纤维的制备

取一根长10 cm直径20 μm的石英纤维，其中1 cm作粘附溶胶凝胶涂层用。将其用丙酮浸泡3 h干燥，再置于1 mol·L-1的NaOH溶液1 h，用蒸馏水洗净，然后放入0.1 mol·L-1HCl溶液30 min以中和表面残留的NaOH，最后用蒸馏水洗净并在氮气保护下干燥备用。将处理好的石英纤维放入制备好的溶胶-凝胶涂层溶液中30 min后，垂直提拉，通过沾取次数来控制涂层厚度。将涂渍好的石英纤维置于室温下24 h，涂层厚度约46 μm，比表面积为0.371 1 m2/g。

自制SPME装置的制备：将5 μL微量进样器针外套取下,前端截去2 cm,与1 μL 微量进样器内芯组装。并将有涂层的石英纤维粘到内芯中固定，之后放在GC进样口中，在较小的氮气流下，先保持温度为120 ℃，干燥60 min，再升温到280 ℃，继续干燥60 min，最后升至320 ℃，处理30 min。

1.4 SPME 萃取步骤

称取0.200 0 g迷迭香于10 mL螺口玻璃样品瓶中，聚四氟乙烯隔垫密封，80 ℃萃取，插入SPME顶空取样60 min,将萃取头插入GC-MS进样口，于260 ℃解吸2 min 后进样分析，经NIST 和Wiley 谱库检索，结合人工谱图解析，确定迷迭香的挥发性成分。

1.5 气相色谱条件

SE-54石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱温：初温50 ℃，保持6 min，以6 ℃·min-1升至160 ℃，再以10 ℃·min-1升至240 ℃。进样口温度260 ℃，检测器温度280 ℃，载气：氮气(99.999%)，不分流进样，流速：1.0 mL·min-1，检测器：氢火焰离子检测器。

1.6 气相色谱质谱条件

HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管柱，柱流量1.0 mL·min-1；柱温：初温50 ℃，保持4 min，以4 ℃·min-1升至180 ℃，再以8 ℃·min-1升至250 ℃，保持5 min。载气：高纯氦气；进样口温度260 ℃，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，离子化能量70 eV，扫描范围29～300 amu。

2 结果与讨论

2.1 涂层的可能结构

以Q[5](OH)10和OH-PDMS 为涂层的固定相，利用OH基团的缩合反应，将溶胶-凝胶形成的三维立体网状涂层化学键合在石英纤维载体上，其形成过程与曾照睿等的报道类似[15]，可能结构如图1。

图1 涂层的可能结构 Fig.1 The possible structure of coating

2.2 涂层的表面形态

图2 是涂层的电镜扫描图。从图2A、2B中可以看出自制溶胶-凝胶涂层的表面致密、均匀、无裂痕，其厚度为44～50 μm，平均厚度为46 μm。图2B显示自制涂层表面呈疏松的孔状结构，图2C、2D是单独孔洞的放大图，表面孔径多为1～4 μm左右。涂层的多孔性增加了涂层的表面积，有利于提高涂层表面的负载能力，增加涂层对样品的萃取吸附能力，提高萃取效率。

图2 各种放大倍数下自制涂层的扫描电镜照片Fig.2 Scanning electron micrographs of homemade coating with variable magnifications A：×22；B：×500；C：×5 000；D：×3 000

图3 空白溶胶-凝胶PDMS(a)、Q[5](OH)10(b)与PDMS/Q[5](OH)10(c)涂层的红外谱图Fig.3 FTIR spectra of blank sol-gel PDMS(a)，Q[5](OH)10(b) and PDMS/Q[5](OH)10(c)coatings

图4 PDMS/Q[5](OH)10涂层在氮气氛围下的TG和DSC曲线图Fig.4 TG and DSC curve of PDMS/Q[5](OH)10 coating in nitrogen gas atmosphere heating rate:10 ℃·min-1

2.3 涂层的结构

2.4 涂层的热稳定性

图4是涂层的差示扫描量热(DSC)和热重(TG)分析图。从图中可看出，PDMS/Q[5](OH)10涂层在氮气气氛下，66.2 ℃时开始失去瓜环结合的结晶水，其质量减少2.42%。在失去水后，加热直至360 ℃其质量均不会发生改变。升温至600 ℃失重也仅为8.93%，这说明利用溶胶凝胶法制备的PDMS/Q[5](OH)10涂层，热稳定性好，其最高使用温度可达360 ℃左右，优于商品化涂层的最高温度(300 ℃左右)，同时也满足气相色谱热解析的温度(250～300 ℃)，方便与气相色谱仪联用。涂层良好的热稳定性可能是源于涂层与石英纤维之间的化学键合作用[17]，并且可以拓宽分析物质的范围，有利于分析沸点更高的化合物。

2.5 涂层的使用寿命

将涂层制备成固相微萃取纤维，以迷迭香中的主要成分1,8-桉叶素和α-蒎烯的峰面积之和为指标，用该自制萃取头连续萃取90次，计算峰面积变化的相对标准偏差(RSD)为6.4%，表明自制萃取头重复性好，使用寿命长，同时也表明使用化学键合方式制备涂层可使萃取头具有较长的使用寿命，能较好地克服商品涂层因涂覆方式使用寿命较短的缺陷。

2.6 萃取条件的优化

以迷迭香中的4种主要成分1,8-桉叶素、樟脑、龙脑和β-石竹烯的峰面积为考察对象，探讨不同萃取条件对萃取峰面积的影响以得到最优的萃取条件。

2.6.1萃取温度采用自制PDMS/Q[5](OH)10萃取头，分别在20、40、60、80、90 ℃条件下对迷迭香挥发性组分进行顶空萃取，经GC 分析获得4种组分的峰面积。结果显示，在温度低于40 ℃时，4种组分的峰面积变化不大，40 ℃后继续升高温度，峰面积不断增大，80 ℃后趋于平衡，因此选择80 ℃作为最优的萃取温度。

2.6.2萃取时间的优化考察不同萃取时间(5、15、30、45、90 min)下4种组分峰面积的变化。结果发现，随着萃取时间的增长，挥发性组分的峰面积逐步增大，直到45 min后达到萃取平衡，因此选择45 min为最佳萃取时间。

2.6.3萃取样品质量的优化分别称取0.050 0、0.100 0、0.200 0、0.300 0、0.500 0 g迷迭香样品，用自制萃取头进行顶空萃取，经GC 分析得到不同样品质量下挥发性组分的峰面积。结果表明，样品质量在0.200 0 g后，挥发性组分的峰面积趋于平衡，因此选择样品量为0.200 0 g。

图5 迷迭香挥发油的GC-MS总离子图Fig.5 Total ion GC-MS chromatogram of essential oil in ROL

2.7 迷迭香挥发性成分的分析

在上述最佳萃取条件下，用46 μm自制的PDMS/Q[5](OH)10萃取头对迷迭香的挥发性组分及其相对含量进行了测定。共鉴定出25种迷迭香成分，占挥发性成分的90.5%(见表1和图5)。含量最高的是1,8-桉叶素、樟脑和α-蒎烯，与文献报道值相符[1-2,4]。其中迷迭香挥发油中的活性成分如蒎烯、莰烯、水芹烯、α-水芹烯、1,8-桉叶素、樟脑、龙脑、乙酸龙脑酯、α-石竹烯等均被萃取并鉴定。为验证自制萃取纤维的萃取效果，以萃取挥发油最常用的商用纤维(PDMS/DVB/CAR)对相同样品进行了顶空固相微萃取并经GC-MS 分析(表1)。从表1中可看出，自制纤维萃取出25种成分，商用纤维萃取出24种，两者共有的成分为20种，并且相对含量相近。对于文献报道中迷迭香挥发油中的优势成分或活性成分，如1,8-桉叶素、樟脑、α-蒎烯、崁烯、龙脑、α-石竹烯、β-石竹烯、α-水芹烯等成分，两种纤维均能萃取出来并且含量相近，说明自制的固相微萃取纤维能有效地萃取植物中的挥发性成分。

表1 迷迭香的挥发性成分及相对含量Table 1 Chemical components in ROL essential oil

(续表1)

No.CompoundMolecularformulaRelativepercentcontent%(mean±RSD%)(n=3)50/30μmPDMS/DVB/CAR46μmPDMS/Q[5](OH)10112,4-Dimethylstyrene(2,4-二甲基苯乙烯)C10H12-0.126±6.512α-Terpinolene(α-松油烯)C10H16-0.523±6.913Linalool(芳樟醇)C10H18O0.866±4.9-14Camphor(樟脑)C10H16O9.340±3.86.654±3.615Borneol(龙脑)C10H18O2.660±4.41.345±5.316Terpinene-4-ol(4-萜烯醇)C10H18O0.520±5.80.512±4.817α-Terpineol(α-松油醇)C10H18O2.560±6.10.949±6.518Bornylacetate(乙酸龙脑酯)C10H20O20.662±7.30.594±6.819Ylangene(衣兰烯)C15H240.128±5.8-20Copaene(古巴烯)C15H240.088±8.50.221±8.121cis-Caryophyllene(cis-石竹烯)C15H24-0.153±5.922Methyleugenol(甲基丁香酚)C11H14O20.170±6.9-23β-Caryophyllene(β-石竹烯)C15H2412.45±3.73.282±4.924α-Caryophyllene(α-石竹烯)C15H240.476±5.50.503±5.825β-Bisabolene(β-红没药烯)C15H240.397±6.30.133±6.126d-Cadinene(d-杜松烯)C15H240.149±5.3-27Caryophylleneoxide(石竹烯氧化物)C15H24O0.338±6.70.088±8.228Hexadecanoic(棕榈酸)C16H32O2-1.578±4.829Oleicacid(油酸)C18H34O24.851±4.110.64±4.2

*no detected

3 结 论

采用溶胶-凝胶技术制备了含全取代羟基五元瓜环的新型固相微萃取涂层。该涂层具有表面积大、热稳定性好、使用寿命长的优点，方便与各类分析仪器联用。利用该新型溶胶-凝胶涂层制备的萃取纤维能有效地萃取迷迭香中的挥发性成分，萃取效果与商用纤维相当，但该自制纤维比商用纤维热稳定性更好。同时，该纤维因为键合制备的方式，涂层不易脱落，比商用纤维更适用于不同的萃取模式(如浸入式萃取)。该自制纤维的制备可为开发高选择性和高效的SPME提供一种新的材料种类和研究思路。

[1] Zhou X.GuizhouSci.(周欣.贵州科学),2002,20(1):78-80.

[2] Gu K,Cheng W X,Li Y C,Li C.J.YunnanUniv.(古昆，程伟贤，李云川，李聪.云南大学学报),2003,25(3):258-260.

[3] Zhang Y H,Wang L.Chin.Pharm.(张玉红,王磊.中国药房),2010,21(47):4441-4443.

[4] Chen Z F,Yang J L,Wang C D,Cui S Y.ChineseTraditionalandHerbalDrugs(陈振峰，杨建莉，王春德，崔树玉.中草药),2001,32(12):1085-1086.

[5] Su X Y,Zhang B.IndustryofChina(苏晓雨，张宝.中国产业),2012,9:22.

[6] Arthur C L,Pawliszyn J.Anal.Chem.,1990,62:2145-2148.

[7] Yu H L,Merbi J,Anderson J L.J.Chromatogr.A,2016,1438:10-21.

[8] Meng J,Wang G,Han M,Zhai Z X,Geng J,Lu F L.J.Instrum.Anal.(孟洁，王亘，韩萌，翟增秀，耿静，鲁富蕾.分析测试学报)，2016，35(12):1611-1615.

[9] Shamsipur M,Yazdanfar N,Ghambarian M.FoodChem.,2016,204:289-297.

[10] Mirzajani R,Kardani F.J.Pharm.Biomed.Anal.,2016,122:98-109.

[11] Wu H Q,Hou S R,Huang X L,Lin X S,Zhu Z X,Huang F,Ma Y F.J.Instrum.Anal.(吴惠勤，侯思润，黄晓兰，林晓珊，朱志鑫，黄芳，马叶芬.分析测试学报)，2016，35(11):1369-1375.

[12] Terzopoulou Z,Papageorgiou M,Kyzas G Z,Bikiaris D N,Lambropoulou D A.Anal.Chim.Acta,2016,913:63-75.

[13] Freeman W A,Mock W L,Shin N Y.J.Am.Chem.Soc.,1981,103(24):7367-7368.

[14] Lee J W,Samal S,Selvapalam N,Kim H J,Kim K.ACC.Chem.Res.,2003,36(8):621-630.

[15] Zeng Z R,Qiu W L,Huang Z F.Anal.Chem.,2001,73(11):2429-2436.

[16] Shu J J,Xie P F,Lin D N,Chen R F,Wang J,Zhang B B,Liu M M,Liu H L,Liu F.Anal.Chim.Acta,2014,806:152-164.

[17] Chong S L,Wang D,Hayes J D,Wilhite B W,Mailk A.Anal.Chem.,1997,69(19):3889-3898.

Preparation of a Novel Solid-phase Microextraction Coating and Its Application in Determination of Volatile Components inRosmarinusofficinalisL.

HE Jing,LI Tao,DONG Mei-yu,DONG Nan*

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

A novel solid phase microextraction coating that contains perhydroxy cucurbit[5]uril was prepared by a sol-gel method.With 3-(2-cyclooxypropoxyl) propyltrimethoxysilane as cross-linking agent,Perhydroxyl cucurbit[5]uril(Q[5](OH)10) and hydroxy-terminated poly(dimethylsiloxane)(OH-PDMS) were used as starting coating material to bond chemically to a fused-silica substrate to form a PDMS/Q[5](OH)10coating by hydrolysis and polycondensation reactions.The surface morphology,microstructure and thermal stability of the obtained composite coating were characterized by scanning electron microscopy(SEM),Fourier-transform infrared spectrometry(FTIR),differential scanning calorimetry(DSC) and thermogravimetric(TG) analysis.The results showed that the coating has a large specific surface area,high thermal stability(360 ℃) and long lifetime.Its performance was tested using a homemade solid-phase microextraction coating fiber coupled with gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS) to analyze volatile components inRosmarinusofficinalisL(ROL).The optimized solid-phase microextraction conditions included an extraction temperature of 80 ℃,an extraction time of 45 min and a 0.200 0 g sample.The volatile components were extracted by head solid-phase microextraction(HS-SPME) with a homemade extraction fiber,and identified by GC-MS.The relative content of each component was determined by area normalization.Twenty-five compounds in the ROL were identified.The main compounds are 1,8-cineole,camphor andα-pinene.The homemade fiber was compared with commercial fiber(PDMS/DVB/CAR).According to the quantity and content of the extracts from ROL,the extraction effect of the two kinds of fiber are equivalent,which indicated that the homemade novel fiber could be applied in the rapid detection of volatile components in plants.

sol-gel technology;solid-phase microextraction coating;perhydroxy cucurbit[5]uril;gas chromatography-mass spectrometry;RosmarinusofficinalisL.(ROL)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.10.003

O657.7;O657.63

A

1004-4957(2017)10-1185-06

2017-05-18；

2017-06-19

国家自然科学基金项目(81160398,21665005)

*

董 南，博士，教授，研究方向：分析化学，Tel:0851-83621679，E-mail:ndong@gzu.edu.cn