高效液相色谱法测定面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二钠的含量

巫立健，赖国银，白 松，林立毅，郑向华，徐敦明，张志刚

(厦门出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，福建 厦门 361026)

高效液相色谱法测定面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二钠的含量

巫立健，赖国银，白 松，林立毅，郑向华，徐敦明*，张志刚

(厦门出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，福建 厦门 361026)

在未使用离子对试剂和高盐缓冲液条件下，采用亲水性C18反相液相色谱柱，以甲醇-水体系为流动相，建立了面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二钠含量的高效液相色谱测定方法。样品采用水溶液提取，在超声辅助下与三氯化铁反应生成稳定的衍生产物，用三氯甲烷净化衍生产物。采用高效液相色谱法以pH 4.0甲醇-水溶液(10∶90，体积比)为流动相，亲水性C18反相液相色谱柱为固定相，260 nm波长下测定面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二钠含量。乙二胺四乙酸二钠的质量浓度在1.0～50.0 mg/L范围内呈良好的线性关系，其相关系数为0.999 6，检出限为3.0 mg/kg，定量下限为10.0 mg/kg。面粉样品添加浓度在10.0～200 mg/kg范围内，加标回收率为95.0%～103%，相对标准偏差为4.0%～6.3%，可满足面粉及面制品中乙二胺四乙酸二钠的快速检测和定量分析要求。

乙二胺四乙酸二钠；面粉制品；高效液相色谱法;亲水性C18反相液相色谱柱

乙二胺四乙酸盐是一类多羧酸氨基络合试剂，能与许多金属离子形成稳定的络合物，广泛地应用于分析化学、临床医学、精细化工和食品加工等领域[1-3]。在食品加工中，目前常用的乙二胺四乙酸盐主要有乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2)、乙二胺四乙酸二钠钙(EDTA-CaNa)、乙二胺四乙酸铁钠(EDTA-FeNa)等。乙二胺四乙酸二钠可与钙、镁、铜、铁等多价离子配位形成稳定的水溶性络合物，可以有效防止金属离子引起的变色、变质、变浊及维生素的氧化损失[4]。然而，乙二胺四乙酸二钠可对粘膜、上呼吸道、眼睛及皮肤产生刺激作用，长期大量食用乙二胺四乙酸二钠超标的产品可能对人体健康产生不良影响[5]。面粉制成品(如面条、饺子皮、馄饨皮等)在制作完成后会出现酶促褐变现象，影响产品营养成分和感官品质。多酚氧化酶是一种面粉中均含有的铜结合酶，是引起面粉制成品返色褐变的主要原因。为延缓面粉制成品的褐变过程，通常加入乙二胺四乙酸二钠、柠檬酸、抗坏血酸等多酚氧化酶抑制剂作用于多酚氧化酶上的铜离子，降低酶活性，减缓酶促褐变过程[6]。相关法规规定，将乙二胺四乙酸二钠应用于面粉及面粉制品中属于超范围使用乙二胺四乙酸二钠[7]。

目前，食品中乙二胺四乙酸盐的检测方法包括气相色谱法[8]、高效液相色谱法[9-10]和液相色谱串联质谱法[11-12]等。食品安全国家标准GB 5009.278-2016采用反相离子对液相色谱法，以甲醇-四丁基溴化铵-乙酸钠混合溶液为流动相测定罐头食品和复合调味料中乙二胺四乙酸盐的含量，样品经阴离子固相萃取柱净化后，对各种复杂基质均具有较好的适用性[13]。行业标准SN/T 3855-2014中液相色谱法选用阴离子交换色谱柱为固定相，以高浓度磷酸盐缓冲体系为流动相，测定饮料和罐头食品中乙二胺四乙酸二钠的含量[14]。然而，离子对试剂易造成色谱柱使用寿命与系统灵敏度降低，高盐流动相体系易堵塞仪器管路，对色谱分离系统造成损伤[14]。

现有的食品安全国家标准中仅提供了罐头食品和复合调味料中乙二胺四乙酸盐的检测方法[13-14，16]，尚未发布面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸盐检测的相应国家标准，同时已报道的文献使用离子对试剂为流动相[17-18]，无法避免离子对试剂对色谱柱寿命、色谱系统灵敏度的损伤。

在无离子对试剂和高盐缓冲液条件下，本文以甲醇-水混合体系为流动相，选用亲水性C18反相液相色谱柱，建立了面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二钠的检测方法。本方法分析过程中避免了流动相中使用离子对试剂和高盐流动相，降低了对色谱分离系统的损伤，同时方法操作简单，灵敏度高。

1 实验部分

1.1 仪器与设备

Agilent 1260高效液相色谱仪配二极管阵列检测器和Agilent OpenLAB CDS ChemStation Rev.C.01.05色谱工作站(美国安捷伦科技有限公司)；色谱柱 Agilent SB-C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)、Agilent SB-Aq C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)、Agilent SAX(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)(美国安捷伦科技有限公司)；BSA224S-CW电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；T890/H超声波清洗机(德国Elma公司)；Milli-Q Advantage Direct 16超纯水系统(德国默克密理博公司)；FE20 FIVEEASY pH计(梅特勒-托利仪器(上海)有限公司)；TGL-16B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 材料与试剂

面粉、面条、饺子皮等面制品均为市售。

甲醇(色谱纯，默克股份两合公司)；浓盐酸、浓磷酸、三氯化铁(FeCl3·6H2O)(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙二胺四乙酸二钠二水合物标准品(CAS号：6381-92-6，纯度≥99.0%，上海安谱科学仪器有限公司)；0.2 μm有机相滤膜(美国安捷伦科技有限公司)；实验用水为Milli-Q超纯水。

1.3 溶液的配制

0.02 mol/L三氯化铁溶液：称取0.54 g三氯化铁，溶于90 mL水中，转移至100 mL容量瓶中，加入0.03 mL盐酸，加入超纯水定容至100 mL，混匀，备用。

1.0 mol/L磷酸溶液：量取68 mL浓磷酸，超纯水稀释，定容至1 000 mL，混匀，备用。

乙二胺四乙酸二钠标准储备溶液：准确称取0.102 0 g乙二胺四乙酸二钠二水合物标准品，用水溶解转移入棕色容量瓶中，加入超纯水定容至50 mL，得到质量浓度为2.0 mg/mL的标准储备溶液，4 ℃条件下储存备用。

1.4 样品处理方法

称取5.00 g面粉或面粉制品，置于50 mL离心管中，加入25 mL水，涡旋混匀，超声30 min，7 500 r/min离心5 min，取上清液置于50 mL容量瓶中。剩余残渣中加入15 mL水重复提取1次，离心后合并上清液，向其中加入衍生化试剂0.02 mol/L三氯化铁溶液1.0 mL，加入超纯水定容至刻度，混匀，室温下超声20 min。取2.0 mL衍生后溶液于4 mL离心管中，加入三氯甲烷2.0 mL，混匀，15 000 r/min离心5 min，弃去有机相，水相过0.2 μm有机滤膜，供高效液相色谱仪测定。

1.5 标准工作溶液衍生化处理方法

吸取1.0 mL乙二胺四乙酸二钠标准储备溶液于10 mL容量瓶中，加超纯水定容至刻度，得到质量浓度为0.2 mg/mL的标准溶液。依次准确吸取0.05、0.10、0.25、0.50、1.00、 2.50 mL该标准溶液于10 mL容量瓶中，加入0.02 mol/L三氯化铁溶液1.0 mL，混匀，加超纯水定容至10 mL。室温下超声20 min后，得到质量浓度依次为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 mg/L的系列标准工作液。

1.6 液相色谱条件

色谱柱：Agilent SB-Aq C18柱(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流动相：甲醇-水体系(10∶90，体积比)，使用1.0 mol/L磷酸溶液调至pH 4.0；流速：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；波长：260 nm；进样量：10 μL。

2 结果与讨论

从分子结构上看，乙二胺四乙酸二钠分子结构中缺少能够产生强烈紫外吸收的共轭结构，因此在紫外区吸收十分微弱，需借助于与过渡金属离子络合形成具有共轭结构的络合物增强紫外吸收[19-20]。已报道文献常以Cu(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)为络合离子，在酸性条件下与乙二胺四乙酸二钠发生衍生化反应得到稳定的乙二胺四乙酸铜络合物或铁络合物，然后采用反相离子对液相色谱法进行分析。鉴于乙二胺四乙酸铁络合物比乙二胺四乙酸铜络合物具有更高的稳定常数[20]，在应用中稳定性、可靠性更佳，因此，本实验以Fe(Ⅲ)为络合离子，与乙二胺四乙酸二钠进行衍生化反应，然后使用配备紫外检测器的高效液相色谱仪测定面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二钠含量。乙二胺四乙酸二钠衍生化反应中三氯化铁的用量、反应时间、反应温度等条件在文献中已有详细报道[21-22]，因此，本文的衍生化反应条件参照已有文献方法。

图1 乙二胺四乙酸铁钠络合物在Agilent SB-C18、SB-Aq C18、SAX色谱柱上的色谱图Fig.1 Chromatograms of coordination compound EDTA-FeNa standard on Agilent SB-C18，SB-Aq C18 and SAX columns

2.1 色谱柱的选择

采用液相色谱检测乙二胺四乙酸二钠的方法中常借助离子对试剂与离子态乙二胺四乙酸阴离子结合生成电中性内盐吸附于固定相中，提高分离效果。黄建等[21]采用以四丁基氢氧化铵为反相离子对试剂的甲酸水溶液为流动相，研究了乙二胺四乙酸二钠在果味饮料中的检测方法。魏冬旭等[22]开发了使用阴离子交换色谱柱分析啤酒、饮料、八宝粥、番茄酱、板栗罐头等基质中乙二胺四乙酸二钠的超高效液相色谱检测方法。然而，离子对试剂和高盐强酸流动相易对色谱分离系统造成不可逆损伤。

在高效液相色谱分析中，影响色谱峰分离效果的因素众多，其中色谱柱是决定因素之一。为得到较好的分离效果及峰形，本实验以不添加离子对试剂的甲醇-水体系为流动相，对Agilent SB-C18(150 mm × 4.6 mm，5 μm)、Agilent SB-Aq C18(150 mm × 4.6 mm，5 μm)、Agilent SAX(150 mm × 4.6 mm，5 μm) 3种色谱柱的分离效果进行了比较。如图1所示，采用“1.6”所述液相色谱条件，Agilent SB-C18和Agilent SAX两款色谱柱对乙二胺四乙酸铁钠络合物的保留能力均较弱，不满足检测要求；乙二胺四乙酸铁钠络合物在Agilent SB-Aq C18色谱柱上的峰形对称、分析时间适中，满足检测要求。因此，本方法选用Agilent SB-Aq C18色谱柱。

2.2 流动相的选择

图2 不同pH值条件下乙二胺四乙酸铁钠的色谱图Fig.2 Chromatograms of EDTA-FeNa standard eluted with mobile phases under different pH value conditions

图3 加标面粉样品的色谱图Fig.3 Chromatograms of spiked flour samplea.spiked flour solution cleaned up by chloroform;b.spiked flour solution uncleaned up by chloroform;c.flour solution;d:standard solution;* stands for peak of EDTA-FeNa

2.2.1流动相pH值的影响以1.0 mol/L磷酸溶液为酸度调节剂，将pH值分别调至3.0、4.0、5.0。在甲醇-水(10∶90)流动相条件下，当流动相pH值为3.0时，乙二胺四乙酸铁钠的保留时间仅4.0 min，保留时间过短，易与样品基质中的干扰物重合；当流动相pH值为5.0时，乙二胺四乙酸铁钠的色谱峰出现峰展宽或双峰，这可能与弱酸性条件下部分乙二胺四乙酸铁钠在流动相中发生水解反应，引起组分的保留性质发生变化有关；当流动相pH值为4.0时，目标物出峰时间在6.5 min附近，保留时间适中，峰形对称，如图2所示。结果表明，流动相pH值会对乙二胺四乙酸铁钠的出峰时间、峰形产生显著影响。因此，为了满足检测要求，选用流动相pH值为4.0。

2.2.2有机相甲醇体积分数的影响以甲醇-水(pH 4.0)体系为流动相，当流动相中甲醇体积分数由10%增至20%时，流动相的洗脱能力增强，乙二胺四乙酸铁钠的保留时间缩短，然而离子化合物在流动相中的溶解度降低导致色谱峰分叉；当流动相中不含甲醇时，流动相的洗脱能力减弱导致目标物出峰延迟和峰展宽。当甲醇为10%时，保留时间适中，峰形对称，因此，最终确定流动相中有机相组成为10%甲醇。

2.3 样品前处理方法的优化

面粉样品加水提取后，形成浑浊的悬浊液，静置离心后，上清液按照食品安全国家标准GB 5009.278-2016[13]的固相萃取柱净化法净化，操作过程中会因提取液中溶解的淀粉大分子有机物析出，造成固相萃取柱堵塞，影响实验结果的准确性。文献报道采用三氯甲烷净化提取[22]，除去杂质，可降低对色谱柱和仪器的损伤。本文以空白面粉为样品，添加50.0 mg/kg乙二胺四乙酸二钠，经水溶液提取，三氯化铁衍生反应后，比较了三氯甲烷的净化结果。结果表明，使用三氯甲烷净化与否，不会在色谱图上产生显著差异(图3)。但使用三氯甲烷为净化试剂时，三氯甲烷与水的两相交界层间存在明显的固体析出，说明三氯甲烷可以发挥沉淀剂的作用，同时不会造成提取液中的乙二胺四乙酸铁钠损失。因此，本文使用操作简单、快速的三氯甲烷净化法净化提取液。

2.4 方法学考察

2.4.1线性范围、检出限与定量下限采用优化色谱条件，对“1.5”配制的乙二胺四乙酸二钠系列标准工作液进行测定，以仪器响应峰面积(Y)对乙二胺四乙酸铁钠络合物的质量浓度(X，mg/L)进行回归分析。结果表明，当乙二胺四乙酸铁钠络合物质量浓度为1.0～50.0 mg/L时呈现良好的线性关系，线性方程为Y=12.965 4X-5.515 4，相关系数为0.999 6。

向空白面粉基质中添加乙二胺四乙酸二钠标准品,以3倍信噪比(S/N=3)确定检出限(LOD)为3.0 mg/kg；以S/N=10确定定量下限(LOQ)为10.0 mg/kg。本方法具有良好的线性范围和灵敏度，适用于面粉基质中乙二胺四乙酸二钠的检测。

2.4.2回收率与精密度分别向不含待测物的面粉中添加10.0、 50.0、 200 mg/kg的乙二胺四乙酸二钠标准品进行测定，每个加标水平平行测定6次，计算平均回收率和相对标准偏差(RSD)，加标样品色谱图见图3。其平均加标回收率为95.0%～103%，RSD为4.0%～6.3%，表明该方法重复性良好、准确可靠，适用于面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸盐含量的测定。

2.5 市售面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸盐的含量

应用本文建立的分析方法，对市售的面粉、面条、饺子皮等90份面粉及其制品进行测定。其中有3份面粉中检出乙二胺四乙酸二钠，含量为110～120 mg/kg；11份面条及饺子皮等面粉制品中检出乙二胺四乙酸二钠，含量为50～80 mg/kg；其余样品中乙二胺四乙酸二钠含量均低于方法检出限。

3 结 论

本实验采用亲水性C18反相液相色谱柱，以甲醇-水(90∶10，体积比)为流动相，建立了测定面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二钠含量的高效液相色谱方法。本方法前处理方法简单、分离效果好，重复性良好、准确可靠，同时可在非离子对试剂和高盐强酸流动相条件下实现面粉及面粉制品中乙二胺四乙酸二钠含量的测定。

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Determination of Disodium Ethylenediaminotetraacetic Acid in Flour and Its Products by High Performance Liquid Chromatography

WU Li-jian，LAI Guo-yin，BAI Song，LIN Li-yi，ZHENG Xiang-hua，XU Dun-ming*，ZHANG Zhi-gang

(Inspection and Quarantine Technology Center，Xiamen Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Xiamen 361026，China)

In the absence of ion-pair reagents or high-salt buffer condition，a novel method for the quantitative analysis of disodium ethylenediaminotetraacetic acid in flour and its products by high performance liquid chromatography was developed，employing hydrophilic C18reversed-phase liquid chromatography column and methanol-water system as mobile phase.Samples were extracted with aqueous solution，and reacted with ferric chloride by ultrasound irradiation to product stable derivative which was cleaned up with trichloromethane.To determine ethylenediaminotetraacetic acid disodium in flour and flour products，the analytes were determined by high performance liquid chromatography with a wavelength of 260 nm and a hydrophilic C18reversed phase liquid chromatography column using mobile phases of pH 4.0 methanol and aqueous solution(10∶90，by volume).Under the optimal conditions，the calibration curves of the analytes were linear in the concentration range of 1.0-50.0 mg/L with the correlation coefficients of 0.999 6.The limits of quantification(LOQs) were 10.0 mg/kg，and the limits of detection(LODs) were 3.0 mg/kg.At spiked levels of 10.0-200 mg/kg，the average recoveries of spiked samples ranged from 95.0%to 103%，with relative standard deviations between 4.0%and 6.3%.The method could meet the requirement for the rapid screening and quantitative analysis of disodium ethylenediaminotetraacetic acid in flour and its products.

disodium ethylenediaminotetraacetic acid;flour products;high performance liquid chromatography;hydrophilic C18reversed-phase liquid chromatography column

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.10.011

O657.7；TS201.6

A

1004-4957(2017)10-1230-05

2017-05-15；

2017-07-05

福建省自然科学基金项目(2014J01057，2017J01020)；国家质检总局科技计划项目(2016IK186)

*

徐敦明，博士，研究员，研究方向：食品安全，Tel:0592-6803438，E-mail:xudm@xmciq.gov.cn