壳聚糖/多壁碳纳米管复合膜电化学手性识别色氨酸对映异构体

张亚会，徐 慧，刘 刚

(鲁东大学 化学与材料科学学院,山东 烟台 264025)

壳聚糖/多壁碳纳米管复合膜电化学手性识别色氨酸对映异构体

张亚会，徐 慧*，刘 刚

(鲁东大学 化学与材料科学学院,山东 烟台 264025)

采用滴涂方式将羧酸化多壁碳纳米管(f-MWCNTs)修饰于玻碳电极(GCE)表面成膜，然后恒电位法在上述修饰电极表面电沉积壳聚糖(CS)膜，形成CS和f-MWCNTs复合膜修饰电极(CS/f-MWCNTs/GCE)，并用于色氨酸(Trp)对映异构体的手性识别。采用扫描电子显微镜(SEM)表征了修饰电极表面形貌的差异，电化学阻抗(EIS)和循环伏安法(CV)研究修饰电极的电化学行为差异。差分脉冲伏安法(DPV)用于区别色氨酸(Trp)对映异构体，分离系数可达2.38。研究发现该修饰电极对L-Trp的DPV响应信号强于D-Trp,检测的线性范围为8.0×10-6～4.0×10-3mol/L，检出限(S/N=3)为5.0×10-6mol/L。该方法简单、经济、快速，对发展其它手性化合物的检测方法提供了参考。

壳聚糖；色氨酸；手性识别；电化学方法

手性是指物质本身不能与其镜像重合的特性，是大自然和生命领域的基本属性，手性广泛存在于生命、药物、食品等科学领域。生命体作为复杂的手性系统，其中的氨基酸是生命物质的基石，作为手性分子(甘氨酸除外)，不同构型的氨基酸在生命科学及其他相关领域发挥着不同的作用。例如:L-氨基酸用于合成人体所需蛋白质，然而一些D-氨基酸不参与蛋白质的合成，两者混淆会对生物体产生不良的反应[1]。色氨酸(Trp)是一种用以建立和维护良好人体氮平衡的重要营养成分，在蔬菜中的含量较少，因此多将其作为营养物质加入到药物和食品中。Trp是复合氨基酸制剂和氨基酸注射液的重要组成部分，广泛应用于医药、食品及饲料等方面。若缺乏这种Trp形成的蛋白质，人类无法生存。L-Trp被称作第二氨基酸，是人体和动物体内一种重要的代谢物，Trp代谢失调会导致糖尿病和神经错乱，其中L-Trp的代谢产物5-羟色胺可以促进睡眠和精神稳定，补充L-Trp可以明显缓解抑郁症患者的病情[2-3]。人体内L-Trp失衡或量不足还会导致多种慢性疾病[4-5]。L-Trp已经用作健康食品、安神药物及饲料添加剂[6]。D-Trp作为一种非蛋白光学活性氨基酸，是抗癌和免疫药物的重要前驱物质[7]。L-和D-Trp在应用领域中发挥着不同的作用，因此，创建简捷方便、速度快、灵敏度高的Trp对映异构体的检测方法具有十分重要的意义。目前Trp对映异构体的检测方法有高效液相色谱法[8]、毛细管电泳法[9]、电化学方法[10-13]等，其中电化学方法因制备过程简单、经济、高灵敏度和高稳定性等优点而被广泛研究[14-15]。

为提高电化学测量的灵敏度，将纳米材料引入电化学传感器领域，例如金纳米粒子(AuNPs)[16]、碳纳米管(CNTs)[17]、石墨烯[11]，这些材料由于具有比面积高、可促进电子转移、增强导电性等特点，极大地促进了电化学传感器的发展[18]，已成为修饰化学和生物传感器电极材料的研究热点。CNTs作为典型的代表，具有尺寸小、比表面积高、化学性质稳定等优良性质，常被用于修饰电极，不仅可以提高电极表面的电子传递能力，还能增大电极表面的负载量。大量研究表明CNTs修饰电极能显著提高电化学响应信号。

壳聚糖(CS)是甲壳素脱去乙酰基的衍生物，是光学活性的阳离子型天然多糖，具有生物相容性、生物可降解性和无毒等特点。由于具有手性环境[19]，CS及其衍生物具有良好的手性识别能力，可用于手性化合物的识别和分离[20-22]。CS分子内具有配位能力的氨基和羟基，可与氨基酸上的羧基和氨基形成氢键，因此可用于Trp对映异构体的识别。Gu等[20]利用恒电位法沉积CS或磺化的CS(SCS)于电极表面，成功手性识别了Trp对映异构体，并检测了L和D型Trp在外消旋混合物中的比例，SCS识别效果优于CS。Qu等[21]采用CV法在电极表面电沉积石墨烯量子点(GQD)-CS复合膜，利用GQD放大电化学信号及提高识别效率和CS的手性微环境，成功识别了Trp对映体。CS具有很好的成膜性，但其导电性和机械稳定性差。本文应用羧酸化的多壁碳纳米管(f-MWCNTs)[23]来提高电化学传感器的导电性和机械性能，再沉积CS(HCl作溶剂)成膜，从而扩展了天然多糖在手性识别领域的应用[24]。张军丽等[25]以CS/f-MWCNTs复合膜修饰电极固定包埋辣根过氧化物酶后对H2O2的电催化氧化效果明显提高。董晓娅等[26]研究了CS/f-MWCNTs复合膜对邻、间、对硝基酚的同时检测，方法具有很好的灵敏度和稳定性，并成功用于实际样品的测定。

本实验首先将f-MWCNTs分散液滴涂于GCE表面，然后恒电位法在上述电极表面电沉积CS膜，从而得到CS/f-MWCNTs复合膜，以f-MWCNTs膜为基底，CS为识别元件构建电化学传感器，用于手性识别Trp对映异构体。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

L-Trp(层析纯，中国惠兴生化试剂厂)，D-Trp(生物试剂，成都艾科达化学试剂厂)，磷酸氢二钠(分析纯，天津市博迪化工厂)，磷酸二氢钠(分析纯，山东省化工研究院)，氯化钠、无水乙醇、KCl(分析纯，山东省莱阳市经济开发区化工厂)，CS(生化试剂，国药集团化学试剂有限公司)，N,N-二甲基甲酰胺(DMF，分析纯，天津市天河化学试剂厂)，铁氰化钾、亚铁氰化钾(分析纯，莱阳化工实验厂)，f-MWCNTs(直径10～20 nm)，0.30、0.05 μm Al2O3粉末。实验用水为超纯水(电导率18.25 MΩ·cm)。

电化学实验均在CHI-660C型电化学工作站上完成(上海市辰华仪器厂)，UV-2550紫外-可见分光光度计(日本岛津公司)，电化学实验采用传统的三电极体系：裸GCE(直径3 mm)或修饰GCE为工作电极，铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl(饱和KCl)作参比电极。

1.2 实验方法

1.2.1溶液配制5.0 mg的f-MWCNTs加至2.5 mL DMF中超声分散至少1 h，得到均匀分散液。CS溶于0.1 mol/L的HCl中，配制成2 g/L的CS溶液。通过磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液配制不同pH值的0.1 mol/L磷酸缓冲溶液(PBS)。

1.2.2电极的修饰首先对未修饰GCE依次用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末抛光处理，超纯水淋洗，然后分别在超纯水、无水乙醇和超纯水中超声处理1 min，N2吹干。最后取3 μL的f-MWCNTs分散液滴到干净的GCE表面，自然晾干，得f-MWCNTs修饰的电极。将该修饰电极浸于5 mL的CS溶液中，在-0.5 V恒电位下扫描150 s，使CS沉积到f-MWCNTs修饰电极表面，自然晾干。

1.2.3检测方法DPV测量：不同的修饰电极为工作电极，铂丝电极为辅助电极，Ag/AgCl为参比电极，上述三电极浸于含0.5 mmol/LL-或D-Trp的25 mL 0.1 mol/L PBS溶液中温育60 s(电势范围为0.4～1.0 V，灵敏度:1.0×10-4)。

CV测量：采用三电极体系在含10 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中做CV测量。参数设置：初始电位-0.2 V，最高电位0.6 V，最低电位-0.2 V，扫速0.1 V/s，灵敏度1.0×10-4。

EIS测量：采用三电极在含10 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中做EIS分析。参数设置：初始电位设为开路电压，最大频率1.0×105，最小频率0.01，其它参数不变。

图1 f-MWCNTs/GCE(A)与CS/f-MWCNTs/GCE(B)的SEM表征图Fig.1 SEM of f-MWCNTs/GCE(A)and CS/f-MWCNTs/GCE(B)

图2 不同修饰电极在含10 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中的CV(A)和EIS(B)响应图Fig.2 Cyclic voltammograms(A)and nyquist diagrams(B) of different electrodes in 0.1 mol/L KCl solution containing 10 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-a.bare GCE,b.f-MWCNTs/GCE,c.CS/GCE,d.CS/f-MWCNTs/GCE

2 结果与讨论

2.1 电极修饰材料的SEM表征

本实验采用恒电位法在f-MWCNTs修饰的电极表面电沉积CS膜，随着电流值的降低，CS逐渐沉积到电极表面，自然晾干完成CS在电极表面的修饰。

采用SEM表征了f-MWCNTs和CS/f-MWCNTs的表面形态。如图1A所示，f-MWCNTs呈弯曲管状网络分布状态，大的比表面积结构有利于增加电极的表面积[27]，也有利于CS有序的沉积。当CS沉积到f-MWCNTs修饰电极表面后(如图1B)，可发现CS在f-MWCNTs表面形成互相编织的较为均一的密集网状结构，CS在电极表面的负载量明显增加，进而增加了手性识别位点，一方面由于f-MWCNTs的含氧基团为CS提供了大量活性位点，另一方面f-MWCNTs与CS发生静电作用，电极的稳定性得到提高。

2.2 不同修饰电极的电化学特性表征

采用CV法(图2A)研究了不同修饰电极在含10 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-的0.1 mol/L KCl溶液中的电化学特性，扫速为0.1 V/s。Trp在裸GCE上的CV曲线有1对可逆的氧化还原峰(曲线a)。当滴涂上f-MWCNTs后，电流响应信号明显增大，峰电位差略有减小(曲线b)，说明f-MWCNTs不仅增大了电极的表面积，还促进了电子的传递。文献报道显示，当CS沉积到GCE表面后，峰电流明显降低，且没有可逆的氧化还原峰，峰电位产生较大偏移，这是由于CS的导电能力弱，不利于电荷的传递[28-29]。但本文将CS于0.1 mol/L HCl电解液中沉积于电极表面，CS膜由于质子化带正电荷，与带负电荷的[Fe(CN)6]3-/4-静电相互作用增强，从而提高了CS/GCE的电化学行为(曲线c)。所以当进一步在f-MWCNTs修饰后的电极表面沉积CS膜后，峰电流明显又增强(曲线d)，说明复合膜成功修饰于电极表面，CS和f-MWCNTs的结合使修饰电极的响应很灵敏，两者之间对修饰电极起到良好的协同作用。

采用EIS对不同的修饰电极做进一步研究(图2B)，并进一步说明电极和电解质溶液界面之间的阻抗差异，在EIS图中低频处的直线部分表示扩散控制过程，高频处的半圆直径代表电子转移反应的电阻[30]。GCE的EIS图高频处的半圆展现了典型的界面电子转移电阻(曲线a)，当f-MWCNTs修饰到电极表面后，高频处的半圆几乎消失(曲线b)，说明f-MWCNTs具有良好的导电性并促进了电极表面的电子传输。然而，CS/GCE高频处的半圆远小于GCE(曲线c)，说明CS成功修饰于电极表面，证实CS电极表面的电子传输和导电性比裸GCE好。CS/f-MWCNTs/GCE的 EIS曲线近似一条直线(曲线d)，f-MWCNTs和CS两者的协同作用又使得复合膜修饰电极界面具有良好的导电性和灵敏度。结果证明不同电极的EIS行为与CV行为一致。

2.3 DPV检测实验条件优化

因为温度、pH值可能对手性识别过程中的CS与Trp氢键作用产生影响，所以考察了温度和pH值对Trp对映体在CS/f-MWCNTs/GCE上电化学反应的影响。结果发现低温和高温条件下，CS/f-MWCNTs复合膜与Trp对映体间的氢键作用比较微弱，Trp对映体识别效果不佳。在25 ℃条件下，CS/f-MWCNTs复合膜与Trp对映体间的氢键作用最强，识别效率最高。在酸性条件下，CS分子中的氨基被质子化，易溶于水，碱性条件下，CS分子中的氨基还原为中性，由于Trp的电负性，CS膜吸附Trp的量会减少。因此pH 7.0条件下，CS/f-MWCNTs 复合膜具有较为合适的静电分布，能使Trp吸附量达到最大，识别效果最优。

2.4 最优条件下Trp对映体在不同修饰膜界面上的DPV响应

图3 Trp对映异构体在CS/GCE(A)与CS/f-MWCNTs/GCE(B)上的DPV响应图Fig.3 Differential pulse voltammograms of L-Trp and D-Trp bound to CS/GCE(A) and CS/f-MWCNTs/GCE(B)0.1 mol/L PBS(pH 7.0) at 25 ℃

在最优条件下，研究了Trp对映体在不同电极上的DPV响应。在0.4～1.0 V电位范围内，Trp在不同电极上的DPV响应图出现1个氧化峰。裸电极和f-MWCNTs/GCE上L-Trp和D-Trp的DPV响应曲线几乎相互重合,说明Trp对映体在这两种电极上不能得到区别，需要在电极表面提供手性环境。但相比GCE，f-MWCNTs/GCE上Trp对映体的峰电位负移为0.676 V，且峰电流值提高了4.6倍，表明f-MWCNTs促进了Trp的电化学氧化反应，对Trp对映异构体具有电催化作用。然而当CS修饰于电极上，L-Trp和D-Trp的DPV氧化峰电流值明显发生了微弱的差异(如图3A)，且L-Trp峰电流值大于D-Trp，峰电位也发生微弱的偏移。说明CS/GCE 对Trp对映异构体存在识别作用，由于不同的空间结构，CS/GCE与L-Trp的作用力强。如图3B，识别效果在CS/f-MWCNTs/GCE上得到进一步提高，且峰电流比值(IL/ID)达到2.38，通过Trp对映体在CS/f-MWCNTs/GCE上的识别效果，可知识别能力是CS和f-MWCNTs的协同作用，相当于CS提供了手性微环境即对映体识别能力，f-MWCNTs不但提高了电子转移效率，同时增大了电极的比表面积以及CS在GCE表面的负载量，提高了识别效率。实验结果表明，CS手性微环境和f-MWCNTs形成复合膜增强了CS与Trp的识别作用，从而增加了手性识别的差异，使CS/f-MWCNTs/GCE成功识别Trp对映异构体。

2.5 Trp对映异构体的浓度对DPV响应信号的影响

为了研究不同浓度的L-Trp和D-Trp在CS/f-MWCNTs/GCE上的DPV响应，采用DPV法分别检测0、0.008、0.5、1、2、4、5 mmol/L的L-Trp和D-Trp在CS/f-MWCNTs/GCE上的峰电流。结果显示，峰电流值随着Trp浓度的增大而增大，且与Trp浓度呈线性关系，Trp对映异构体的检测线性范围为8.0×10-6～ 4.0×10-3mol/L，检出限(S/N=3)为5.0×10-6mol/L，L-Trp的线性方程为Ip=27.73cL-trp+19.26(r2=0.994 7)，D-Trp的线性方程为Ip=27.76cD-trp+8.09(r2=0.997 1)。结果表明，该复合膜具有检测浓度范围较宽，灵敏度较高，检出限低等优点。

2.6 Trp与CS结合常数的测量

由于CS与Trp的结合常数与对映体选择性识别有密切的关系，利用紫外可见光谱(UV-Vis)测量了Trp对映异构体与CS的结合能力差异。结果显示，L-Trp和D-Trp在278 nm处的吸光度随着CS量的增加而增大，根据Trp在278 nm处的紫外吸收特征峰的吸光度来计算CS与Trp的结合常数[31]。CS和Trp对映异构体之间的稳定结合常数见表1。依据文献计算方法[32]，通过下式得CS和Trp对映异构体的化学计量比和稳定结合常数。

表1 CS和Trp在25 ℃时不同pH值下的结合常数Table 1 Binding constant(K) for D- and L-Trp with CS at 25 ℃ with various pH values

3 结 论

本文以f-MWCNTs修饰的GCE为基底电极，在其表面电沉积CS膜，构建CS/f-MWCNTs复合膜修饰的电化学传感器，并用于Trp对映异构体识别。实验结果表明，该复合膜对L-Trp的识别能力强于D-Trp。该方法具有响应快速、检测简单、成本低等优点，为该电化学传感器用于其它手性化合物的分析提供了一定的参考价值。

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Enantioselective Recognition of Tryptophan Enantiomers Using Chitosan/Multi-walled Carbon Nanotube Modified GCE

ZHANG Ya-hui,XU Hui*,LIU Gang

(School of Chemistry and Materials,Ludong University,Yantai 264025，China)

The dispersed multiwalled carbon nanotubes with carboxyl(f-MWCNTs) were firstly dropped on the glass carbon electrode to allow a f-MWCNTs menbrance formed on the electrode surface,then chitosan(CS) was electrodeposited on the surface of the eletrode via potentiostatic method to develop a CS/f-MWCNTs/GCE which was used for the chiral recognition of tryptophan enantiomers.The surface morphology of the eletrode was characterized via scanning electron microscopy(SEM).Cyclic voltammetry(CV) and electrochemical impedance spectroscopy(EIS) were used to investigate the electrochemical behavior difference of the modified electrode.Differential pulse voltammetery(DPV) was employed to investigate the stereospecific recognition of tryptophan(Trp) enantiomers with a separation coefficient of 2.38.The results showed that the CS/f-MWCNTs/GCE displayed a more strong DPV response forL-Trp than that forD-Trp in the linear range of 8.0×10-6-4.0×10-3mol/L with a detection limit of 5.0×10-6mol/L(S/N=3).Meanwhile,it provided a beneficial reference for the discrimination of other chiral enantiomers.

chitosan;tryptophan;enantioselective recognition;electrochemical method

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.10.007

O657.1；TP212.2

A

1004-4957(2017)10-1208-06

2017-05-08；

2017-06-22

山东省自然科学基金(ZR2016BM27);山东省重点研发计划(2016GNC111016);烟台市重点研发计划(2016ZH059)

*

徐 慧，博士，教授，研究方向：纳米生物传感器，Tel:0535-64253159，E-mail:xuhui235@163.com