microRNA在糖尿病肾病小管间质纤维化中的作用

谢沂均 张 倩 薛耀明

·基础医学·

microRNA在糖尿病肾病小管间质纤维化中的作用

谢沂均 张 倩 薛耀明

糖尿病肾病是糖尿病一个主要的微血管病变，临床上以持续白蛋白尿和(或)肾小球滤过率进行性下降为主要特征。研究发现，肾小管间质病变与糖尿病相关慢性肾脏病肾脏功能恶化的相关性较肾小球病变更为密切。microRNA(miRNA)是生物小分子，已成为糖尿病肾病研究领域的新方向，被证实与糖尿病肾病的发生、发展相关，miRNA参与肾小管间质纤维化，导致肾小管结构改变和功能障碍。本文就miRNA参与糖尿病肾病肾小管病理生理过程作用机制的作一综述。

糖尿病肾病 microRNA 肾小管间质纤维化 细胞外囊泡

糖尿病肾病是糖尿病引起的严重和危害性最大的一种慢性并发症，随着糖尿病患病率在我国的不断增长，糖尿病肾病已经超过了肾小球肾炎相关慢性肾脏病，成为我国慢性肾脏病的首要病因[1]。目前，尿蛋白肌酐比值(albumin-to-creatinine ratio，ACR)和肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)，仍作为评估肾小球损伤和肾功能的标准方法。在过去一个世纪，医学的进步改善了糖尿病的管理，大大提高了糖尿病患者的存活率，但这些标准护理方法仍然无法消除糖尿病肾病的风险，提示了进一步寻求新的糖尿病肾病的早期诊断标准的必要性。既往认为糖尿病肾病以肾小球系膜细胞病变为主，但研究发现，肾小管损伤在糖尿病肾病早期即可出现，且可先于肾小球疾病[2]。近年研究发现microRNA(miRNA)可能成为糖尿病肾病的新的诊断标志与治疗靶点，本文就miRNA在糖尿病肾病中肾小管间质纤维化机制进行综述。

糖尿病肾病的发病机制

糖尿病肾病的发病机制至今尚不明确，研究显示，糖尿病肾损伤始于高血糖，受到一些相关危险因子的影响，通过启动细胞因子，造成肾脏及其他一些重要脏器的损害。糖尿病肾病早期临床表现为高滤过状态与微量白蛋白尿，无论是1型还是2型糖尿病，其病理生理变化是相似的，反映在肾小球和肾小管细胞内外的紊乱，包括肾小球和肾小管的增生、肥大，出入球小动脉玻璃样变，尤其以出球小动脉的玻璃样变更具特征性[2]。既往认为糖尿病肾病最重要的结构变化发生在肾小球，包括肾小球基膜增厚、系膜扩张、足细胞损伤、肾小球硬化。然而，随着研究深入，发现肾小管也同样有重要的结构改变，即近曲小管基膜增厚、肾小管萎缩及细胞凋亡增加、肾间质炎性浸润、肾间质纤维化、管周毛细血管稀疏等[3]。Mason等[24]研究发现，在2型糖尿病合并微量或大量蛋白尿的患者中，40%有肾小管间质损伤，尤其是近曲小管损伤，而同时仅仅伴有轻微的肾小球损伤。

糖尿病肾病小管损伤机制

越来越多的研究表明，肾小管上皮细胞(proximal tubular epithelial cell，PTEC)在糖尿病肾病发病机制中起重要作用。糖尿病导致的基质改变，如高糖环境、尿蛋白的产生、糖化血红蛋白的波动、晚期糖基化终产物的堆积、血管紧张素II及生长因子的升高，诱导肾小管上皮细胞激活了信号通路，包括核因子κB(NF-κB)、蛋白激酶C(PKC)、Smad3[5]、细胞外信号调节激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK)[6]，p38信号转导[7]与转录激活子-1(signal transducer and activator of transcription-1，STAT-1)[8]，使活性氧(ROS)堆积[5]。最近研究发现，激肽释放酶-激肽系统(kallikrein-kinin system，KKS)与Toll样受体(toll-like receptors，TLR)均参与糖尿病肾病，肾小管上皮细胞上激肽释放酶1(kallikrein 1，KLK1)[9]，TLR2和TLR4[10]均表达升高。各种趋化因子、间质的积累，共同导致肾小管上皮细胞周期停滞，细胞肥大、衰老，导致糖尿病肾病小管间质纤维化的发生。

miRNA的结构与功能

miRNAs是一类大小约为22个碱基的内源性非编码小RNA，是基因表达转录后重要的调节因子，近年来miRNAs已经成为研究热点。miRNA与RNA诱导的基因沉默复合物(RNA-Induced silencing complex，RISC)形成复合物[11]。RISC复合物通过促进mRNA降解或抑制mRNA翻译，抑制其靶基因的表达，实现对靶基因的转录后调控。根据序列互补程度分类，当RISC复合物中的miRNA引导靶基因的识别，其作用机制有两种方式：如果与靶基因完全互补，RISC会直接切割靶mRNA(经典RNA干扰)，引起mRNA的直接降解，这类miRNA的结合位点通常都在靶基因mRNA的编码区或开放阅读框中。如果与靶基因mRNA不完全互补，RISC则通过与靶基因mRNA的3’非翻译区(3′UTR)不完全互补结合来抑制靶基因的翻译，并可影响mRNA的稳定性，绝大多数哺乳动物中的miRNA都通过这一方式发挥调控作用。miRNA参与许多生物过程，越来越多证据表明，miRNA在糖尿病及其并发症的发病机制中扮演重要的角色。

miRNA和糖尿病肾病小管间质纤维化

转化生长因子β(TGF-β)在糖尿病肾病过程中扮演着重要的角色，广泛存在于各类上皮细胞的E-钙黏素(E-cadherin)是一类介导同种细胞互相黏附的钙依赖性跨膜糖蛋白，在保持肾小管上皮细胞完整性和极性中起重要作用，其表达缺失是肾小管上皮细胞转分化(EMT)的标志之一。既往认为糖尿病主要引起肾小球病变，随着研究深入，人们逐渐对糖尿病肾小管损伤重视起来。

促小管间质纤维化的miRNA

miR-125b miR-125b为血管紧张素转化酶2 (ACE2)的负调节因子。人肾小管上皮细胞(HK-2)中，高糖上调miR-125b表达，miR-125b通过抑制ACE2的表达，促进ROS堆积与细胞凋亡[12]。

抑制小管间质纤维化的miRNA

miR-302a-3p 高糖状态下，过表达miR-302a-3p可逆转HK-2细胞转分化，这一过程可能与E盒结合锌指蛋白1(zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)相关，即miR-302a-3p可能通过ZEB1对高糖诱导的HK-2细胞转分化起保护作用[13]。

miR-153 体内实验发现，与db/m相比，miR-153在db/db小鼠肾皮质中表达显著下调，且miR-153与Snail表达水平负相关。高糖诱导的肾小管上皮细胞miR-153表达下调，E-cadherin表达减少；过表达miR-153抑制HK2细胞表达Snail，而E-cadherin水平增加，提示MiR-153可能通过靶基因Snail参与调控高糖诱导的HK2细胞EMT[14]。

miR-30c miR-30c集中分布在肾小球和肾小管上皮细胞内皮层。在kk-ay糖尿病小鼠模型中，下调的miR-30c可能通过增加结缔组织生长因子(CTGF)的表达促进糖尿病肾病发生，同时增加Ⅳ型胶原(COL)、纤维连接蛋白(FN)等表达；增加miR-30c则可减少肾脏纤维化以改善肾脏结构[15]。Zheng等[16]发现，与miR-30c协同调控靶基因CTGF的还有miR-26a、miR-26a和 miR-30c可共同抑制CTGF表达，降低ERK1/2 和p38的磷酸化。同时，miR-30c还可抑制Snail1表达。在大鼠近端肾小管上皮细胞(Rat proximal-tubular epithelial cells，NRK52E)与自发性Ⅱ型糖尿病模型(OLETF)大鼠的肾皮质中，TGFβ1通过抑制miR-26a和 miR-30c表达，激活ERK1/2 和p38通路，上调Snail1表达，协同导致肾脏纤维化。

miR-23b 高糖诱导的HK2细胞和db/db小鼠肾组织中miR-23b水平明显降低。在HK2细胞，过表达miR-23b减轻高糖诱导的EMT。miR-23b通过靶向调控高迁移率族蛋白2(high mobility group A，HMGA2)抑制EMT，从而抑制PI3K-AKT信号通路激活。在db/db小鼠中，过表达miR-23b可减少EMT表达，减少EMT相关基因的表达水平。糖尿病肾病中，miR-23b通过靶向调控HMGA2抑制PI3K-AKT通路来抑制EMT[17]。

Let-7家族 在TGF-β1诱导的 NRK52E中，检出肾脏纤维化指标升高，let-7b表达下降，这些变化在糖尿病肾病早期与晚期小鼠、非糖尿病肾脏纤维化的小鼠模型中均能验证。而过表达的let-7b可通过结合TGF-β1受体的3′UTR抑制TGF-β1受体的表达，同时减少细胞外基质蛋白的表达，减低Smad3活性，对抗TGF-β1诱导的的肾脏纤维化[18]。let-7d靶向调控HMGA2，在高糖联合TGF-β1诱导的 NRK52E中，TGF-β1通过抑制let-7d上调HMGA2表达，导致肾脏纤维化，这些变化在单侧输尿管梗阻小鼠模型中也得到验证[19]。

miR-29 在糖尿病大鼠模型中可检测miR-29与血肌酐呈负相关。在体外实验中，NF-κB通过直接结合到miR-29启动子抑制miR-29表达，通过荧光素酶发现miR-29靶基因为Keap1。在高糖诱导肾小管上皮细胞中，SIRT1去乙酰化酶活性减弱，其负相关NF-κB活性升高，下调的miR-29通过促成KEAP1表达升高，最终Nrf2因泛素化含量降低，增强肾脏氧化应激与亚硝化应激。即高糖刺激的肾小管上皮细胞通过Sirt1/NF-κB/microR-29/Keap1通路导致细胞损伤，而过表达miR-29可增强小管上皮细胞活力[20]。同时，除了近端小管细胞，在系膜细胞与足细胞中均可见TGF-β1抑制miR-29a/b/c/家族导致细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的沉积与合成增加[21]。在非糖尿病肾病中，也发现TGF-β/Smad3通路通过抑制miR-29促进肾纤维化[22]。

作用存在争议的miRNA

miR-21 miR-21是肾纤维化过程的关键因素之一，Wang等[23]通过原位杂交研究表明,在kk-ay小鼠模型中，miR-21主要是分布在皮质肾小球和肾小管细胞，通过调节基质金属蛋白酶-9/组织抑制因子-1(matrix metalloproteinases-9，tissue inhibitors of metalloproteinase-1，MMP9/TIMP1)通路促纤维化。体内体外实验均表明miR-21负向调控Smad7，低水平Smad7与肾损伤相关。Zhong等[24]在2型糖尿病小鼠模型(db/db小鼠)中发现，肾脏miR-21的表达与db/m(+)小鼠相比，增加了两倍。而敲除小鼠的miR-21，可以恢复Smad7水平，尿蛋白与肾脏纤维化和炎症明显减轻。但林莉等[25]则通过体外实验发现，高糖培养的肾小管上皮细胞中miR-21表达降低，Smad7相应升高。结合体内体外实验的区别，目前考虑miR-21在体内可缓解大鼠的糖尿病肾病进展，除了通过对Smad7的调节[26]，还能通过调节Smad2、PTEN、Smad3/PI3K-AKT[27]的表达来实现。其他研究表明，miR-21通过多种通路在非糖尿病肾病，如IgA肾病中，也起着促纤维化作用[28-29]。

miR-192、miR-215 Kato等[30]首先发现，miR-192在STZ诱导的1型糖尿病小鼠和db/db小鼠的肾小球中明显升高，伴随胶原1α2的水平升高。Wang等[31]发现在TGF-β诱导的大鼠肾小管上皮细胞中，miR-192及miR-215表达下降，对ZEB2的抑制减弱，由于ZEB2是E-cadherin的抑制蛋白之一，因此ZEB2上调，使E-cadherin表达降低，最终促进EMT。Krupa 等[32]在肾脏活检中发现miR-192表达与肾小球滤过率下降及肾小管间质纤维化呈负相关。体外实验证明TGF-β诱导的人肾小管上皮细胞中，miR-192表达下降，而过表达miR-192则会抑制阻遏蛋白ZEB1、 ZEB2，对抗TGF-β调节的E-cadherin表达降低，从而减缓EMT的发生。同样的，miR-192在其他肾病，如马兜铃酸肾病[33]的肾纤维化中扮演着重要的角色。

细胞外囊泡(EVs)的miRNA EVs根据其直径分为两类：微泡(100～1 000 nm)和外泌体(30～150 nm)[34]。EVs是由不同的细胞分泌，可从体液隔离，包括血浆、尿液、乳汁、和唾液中分离。EVs含有能反映其来源细胞生理状态的多种蛋白质、microRNAs及mRNAs。尿液EVs由肾单元释放，反映肾损害的进展，可以作为“体液活检”。正常及高糖培养下的肾小管上皮细胞分泌的EVs中的miR-192水平较高，可通过检测EVs的miR-192可反映肾小管功能。糖尿病肾病患者尿液EVs中miR-192表达较正常对照、糖尿病对照组升高，同时亦在高糖条件下的肾小管上皮细胞的细胞上清液EVs中检测到差异表达的miR-192。提示了尿液EVs的miR-192是早期糖尿病肾病的生物标志物[35]。

展 望

miRNA参与肾小管间质纤维化，导致肾小管结构改变、功能障碍。在糖尿病肾病的发生和发展过程中，miR-125b高表达， miR-302a-3p、miR-153、miR-30c、miR-23b低表达，miR-21、miR-192、miR-215表达水平仍需进一步验证(表1)。同样的，miRNA在不同细胞可能发挥不同或相反的作用，也有越来越多研究发现miRNA对糖尿病肾病多条信号通路都有调控作用。作为近年最热门的生物小分子，越来越多的miRNA被鉴定，但仍有miRNA的功能及机制尚未明确，甚至存在争议，还有大量miRNA的功能有待科学家们去探索。同时，miRNA在糖尿病的发生发展，以及糖尿病其他并发症都是重要参与因素，通过对糖尿病及其并发症相关miRNA的研究将有助于诊断和理解糖尿病及其并发症的发病机制，发现新的生物学标记物。

因此，miRNA是一种非常有前景诊断标志物。有助于糖尿病肾病及其他并发症的早期诊断，成为预测靶标。同时，结合研究发现，过表达保护肾脏的miRNA，或者抑制促肾纤维化的miRNA，可增强肾小管细胞活力，改善肾形态、糖原累积、纤维化反应和改善肾脏功能。针对miRNA及其靶基因的调控的研究，在治疗糖尿病肾病具有潜在的作用。

表1 miRNA在糖尿病肾病小管间质纤维化中的作用

ACE2：血管紧张素转换酶2；ROS：活性氧；ZEB1：E盒结合锌指蛋白；ERK1/2：细胞外信号调节激酶1/2；HMGA2：高迁移率族蛋白2；NF-κB:核因子κB；TGF-β1:转化生长因子β1；MMP9：基质金属蛋白酶9；TIMP1：组织抑制因子1;CTGF:结缔组织生长因子；DN：糖尿病肾病

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microRNAonrenaltubularinterstitialfibrosisindiabeticnephropathy

XIEYijun,ZHANGQian,XUEYaoming

SouthernMedicalUniversityNanfangHospital,DepartmentofEndocrinologyandMetabolism,Guangzhou,510515

Diabetic kidney disease is a major microvascular complication in diabetes, and the clinical features is persistent proteinuria and (or) decline of glomerular filtration rate. It was found that compared to glomerular disease, the correlation between renal tubular injury and renal function deterioration of diabetic kidney disease is higher. microRNA (miRNA) is a group of short noncoding RNAs, which has become a new direction in the research field of diabetic kidney disease, and it has been proved to be related to the occurrence and development of diabetic kidney disease. miRNA is involved in tubule-interstitial fibrosis, leading to renal tubular injury and dysfunction. The purpose of this review is to summarize the research achievements about the mechanism of miRNA involved in the pathological and physiological processes of diabetic kidney disease.

diabetic kidney disease microRNA renal tubular interstitial fibrosis extracellular vesicles

2016-12-21

(本文编辑 加 则 子 慕)

10.3969/j.issn.1006-298X.2017.05.014

南方医科大学南方医院内分泌代谢科(广州，510515)