促红细胞生成素产生细胞与肾脏纤维化

邵 芳 综述 谢红浪 审校

·肾脏病基础·

促红细胞生成素产生细胞与肾脏纤维化

邵 芳 综述 谢红浪 审校

肾脏中合成红细胞生成素(EPO)的细胞称为肾脏促红细胞生成素产生细胞(REPs)，EPO生成不足会引起肾性贫血和慢性疾病相关性贫血。REPs可转分化成致瘢痕的肌成纤维细胞(MF)，造成肾脏纤维化，在慢性肾脏病(CKD)患者中，REPs转分化成肌成纤维细胞(MF-REPs)后产生EPO能力下降。近年来关于肾脏REPs的研究取得较大进展，对REPs的研究将有望成为治疗肾性贫血和肾间质纤维化的新靶点。

红细胞生成素 促红细胞生成素产生细胞 肾间质纤维化

红细胞生成素(EPO)是一种促进红细胞生成的糖蛋白类激素[1]，大约90%由肾间质成纤维细胞合成，通常将这些细胞命名为肾脏促红细胞生成素产生细胞(REPs)[2]，EPO通过与促红细胞生成素特异性受体(EPOR)结合而发挥其促红细胞生成作用[3]。1977年， Miyake等[4]从再生障碍性贫血患者的尿液中分离提纯了EPO，基于此发现，于1985年通过基因重组技术合成了重组人促红细胞生成素(rhEPO)，临床上用于治疗终末期肾病(ESRD)相关贫血[5]。肾脏纤维化是各种慢性肾脏病(CKD)进展至ESRD的共同途径，肌成纤维细胞(MF)具有活跃的增殖和分泌胶原的能力，是细胞外基质(ECM)的主要来源，从而造成肾脏纤维化。近期研究表明REPs是MF的主要来源，转化成肌成纤维细胞的REPs(MF-REPs)可在疾病损伤修复后恢复REPs的生理特性，提示肾性贫血和肾脏纤维化在一定程度上可被逆转。本文综述REPs与肾脏纤维化之间的研究进展。

REPs的识别

在EPO基因被克隆前，研究者分离肾皮质肾小球和肾小管，用抗EPO抗体分别测定不同组分中的EPO及EPO-mRNA的水平，并通过细胞培养测定EPO含量来确定REPs，受到方法限制，结果多不一致。EPO基因克隆后，用原位杂交及免疫组化技术测定细胞内EPO-mRNA，使人们对REPs有了更为准确的认识，大多数学者认为EPO由肾皮质间质细胞合成，但具体为何种细胞仍不清楚。1993年，Maxwell等[6]用转基因小鼠技术发现循环系统中约90%的EPO来源于肾脏，肾皮质小管周围的成纤维细胞是EPO最初的产生部位。2008年Obara等[7]利用标记有绿色荧光蛋白(GFP)的转基因小鼠(Tg-EPOGFP)标记能产生EPO的细胞。2011年，Pan等[8]在标记GFP能产生内源性EPO细胞的转基因小鼠(KI-EPOGFP)模型体内用标记绿色荧光的蛋白标记能产生内源性EPO的细胞。结果显示，在正常情况下，只有少量肾间质细胞可被绿色荧光蛋白标记，在贫血和低氧的刺激下，GFP+的细胞数增加，间质中GFP+的细胞为成纤维细胞样细胞，可表达微管相关蛋白2、神经生长因子受体和神经丝轻链多肽，将这些成纤维细胞样细胞命名为REPs[9]。为进一步识别REPs，2013年Yamazaki等[10]利用遗传性超级贫血转基因小鼠(ISAM)，研究结果显示与出血诱导急性贫血的Tg-EPOGFP或KI-EPOGFP模型相比，ISAM慢性重度贫血模型表达绿色荧光蛋白的REPs数量明显增多，因此，GFP+REPs只是总REPs的一部分。为了识别总的REPs，Souma等[11]将Tg-EPOCre转基因小鼠与带有R26Rtd番茄红的小鼠交配，交配后的小鼠再次与ISAM交配，得到ISAM-REC(ISAM:R26RtdTomato:Tg-EPOCre)小鼠，结果显示，在肾皮质、外髓中几乎所有的成纤维细胞样的细胞都探测到番茄红荧光，这些被番茄红荧光标记的成纤维细胞样的细胞称之为REPs。

REPs的生理功能

产生EPO是REPs最重要的生理功能。在胚胎期，肝脏是合成EPO的主要场所；出生后，EPO主要由肾脏分泌合成[12]。通过对产生EPO的人肝肿瘤细胞系(Hep3B和Hep2G)及一些转人类EPO基因小鼠的研究证实，低氧可诱导REPs合成EPO[13]。一项著名的生理学研究显示，缺氧可刺激离体灌注小鼠肾脏分泌EPO[14]。Dimke等[15]敲除小鼠肾脏血管内皮生长因子基因，减少肾脏血管、引起肾脏缺氧，发现EPO分泌增加，表明氧含量是EPO合成的主要调节因子，任何引起肾脏氧供不足的因素，如贫血、缺氧或肾血流减少，均可促进EPO的合成与分泌，使血浆EPO含量增加。低氧促进EPO基因表达的机制与低氧诱导因子1(HIF-1)有关[16]。EPO基因表达调控的机制见图1。

图1 红细胞生成素(EPO)表达调控的机制[2]低氧状态下，脯氨酰羟化酶1(PDH1)介导的羟基化作用被抑制，低氧诱导因子1α(HIF-1α)亚基比较稳定，与低氧诱导因子1β(HIF-1β)亚基一起形成异二聚体复合物，转移到细胞核，与5′端-14 kb至-9.5 kb肾脏增强区结合，上调EPO基因的表达；肝脏EPO基因3′端-0.7 kb的增强区与低氧反应元件(HREs)结合并激活EPO靶基因，从而上调EPO基因的表达。常氧状态下，脯氨酰羟化酶1使低氧诱导因子-1a亚基的脯氨酸残基羟基化，被羟化的残基与von Hippel-Lindau肿瘤抑制蛋白结合(VHL)，触发泛素-蛋白酶体蛋白水解途径，使其迅速降解

Koury等[18]采用原位杂交自显影法测定不同贫血程度小鼠REPs的分布，发现随着贫血程度的加重，REPs逐渐增多，其分布区域也从起始时的皮髓交界处逐步扩展至被膜下肾皮质[19]。同时发现不同程度缺氧对REPs数目的变化与缺氧程度高度相关，与贫血对小鼠刺激时的变化基本一致，说明贫血与缺氧刺激EPO合成的机制相同，使REPs的分布从氧含量低的近髓区扩展至整个皮质。REPs正常处于静息(OFF-REPs)和活化(ON-REPs)两种状态，ISAM-REC肾脏中，约10%的番茄红荧光阳性细胞表达EPOGFP，称之为活化状态 (tdTomato+GFP+)，剩余90%的REPs称之为静息状态(tdTomato+GFP-)[10]。血浆中EPO水平被EPO基因表达的“活化-静息”开关控制，低氧时，打开EPO基因开关，REPs由静息状态转换为活化状态，常氧状态时，大部分REPs处于静息状态；急性贫血时，一部分REPs由静息状态转换为活化状态，活化状态REPs分布区域扩展至皮质低氧区；慢性贫血时，大部分REPs由静息状态转换为活化状态，活化状态REP的募集反应取决于肾脏分泌的所有的EPO数量[11](图2)。

图2 REPs中EPO合成调控[17]A：常氧状态下，REPs处于静息状态；低氧时， EPO基因开关打开，REPs由静息状态转换为活化状态；B：正常状态时，REPs处于静息状态(OFF-REPs，棕色点)；急性贫血时，一部分静息状态的REPs转换为活化状态(ON-REP，绿色点)，活化状态的REPs扩展至皮质低氧区；慢性贫血时，大部分静息状态的REPs转换为活化状态

REPs与肾脏纤维化

纤维化的本质是组织发生损伤之后的修复过程，当其失去调控时，会导致持久组织纤维化、纤维组织形成、结构破坏和器官功能衰竭[20]。肾脏纤维化是CKD进展的重要结局。ECM合成增多和(或)降解减少，致使ECM合成和(或)降解失衡是纤维化形成的主要机制。肌成纤维细胞是合成ECM最主要的细胞[21]。生理情况下，肾小球和肾间质中几乎不存在肌成纤维细胞，在病理状态下，肾小球系膜区、小管周围纤维化区、间质区及血管周围聚集大量增殖、活化的肌成纤维细胞[22]。

肌成纤维细胞的主要来源目前，关于肌成纤维细胞的来源尚不清楚，一直存在较大争议。很多学者假定导致肾脏纤维化中肌成纤维化细胞的来源于周细胞、肾脏固有成纤维细胞、肾小管上皮细胞、内皮细胞、纤维细胞和(或)骨髓源性肌成纤维细胞，拟通过遗传谱系示踪技术明确其确切来源[23]，但是目前关于肾脏纤维化的细胞来源仍然探索中[24]。Humphrys等[25]利用基因谱系示踪技术证实FoxD1+间质衍生的周细胞是肌成纤维细胞的前体细胞，其他研究团队的结果显示在肾间质纤维化过程中，MF主要来源于肾脏固有成纤维细胞。Souma等[11]用单侧输尿管梗阻(UUO)大鼠肾纤维化模型证明REPs是MF的主要来源，以上三种细胞有相似的分子标志物(血小板源性生长因子受体β：PDGFRβ、CD73)、位置分布和形态学特征。最近Kramann等[26]报道了一小部分有间充质干细胞特征的周细胞是肾脏损伤后促进肾脏纤维化发生、发展的主要细胞，表明肾脏肌成纤维细胞起源于一部分Glil+的 EPOCre标记的REPs，但是这个假说需要进一步论证。

REPs具有可塑性有研究表明，肾脏结构的破坏，包括纤维化具有可逆转性[27](图3)。临床上约有10%的透析患者，不需要依赖rHuEPO，仍能维持较高水平的血细胞比容，这表明即使患者进入ESRD，仍可以保留MF-REPs产生EPO的功能[28]。Souma等[11]进一步采用可逆性UUO肾纤维化模型证实，在梗阻解除后MF-REPs可恢复其生理特性、形态及产生EPO的能力。正常情况下，REPs处于静息状态，不分泌合成EPO[2]，当肾损伤或发生炎症反应时，细胞炎症因子[如转化生长因子β(TGF-β)]通过Smad蛋白(SMAD)和核因子кB(NF-кB)信号通路，使REPs活化并转分化成表达α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的 MF-REPs，分泌更多的ECM，造成肾脏纤维化[11]。

图3 REPs具有可塑性[17]UUO：单侧输尿管梗阻；EPOGFP：EPO绿色荧光蛋白；ECM：细胞外基质；NF-кB：核因子кB；SMAD：Smad蛋白；α-SMA：α平滑肌激动蛋白；HIF-2α:低氧诱导因子2α;A：可逆的UUO模型，将肾脏左输尿管梗阻2d，造成输尿管损伤；梗阻解除，恢复肾脏输尿管正常血流；B：可逆的UUO模型中小鼠EPOGFP和α-SMA mRNA的表达；C：REPs可塑性：肾损伤时，通过SMAD和NF-кB信号通路， MF-REP产生ECM和炎症细胞因子，致损伤因素消除后，MF-REP恢复其合成EPO生理表型。REPs静息状态和活化状态之间的转换由低氧诱导的方式通过HIF-2α激活决定

所以，REPs在肾脏纤维化过程中不仅是“受害者”还是“参与者”[29]。因此，已经发生表型改变的细胞能否恢复其正常表型是肾脏纤维化是否可逆转的关键，REPs转分化为肌成纤维细胞是肾损伤纤维化发生的早期事件，抑制REPs向肌成纤维细胞转化，干预其在肾脏中的增殖、聚集、活化等都为肾脏纤维化的防治提供新的思路。随着对REPs可塑性的认识，在各种损伤因素的刺激下，其转分化为肌成纤维细胞的过程是可以逆转的。由于肾脏纤维化的发生机制错综复杂，涉及很多因素，治疗的靶点不止一个，特别是对去分化、分化过程认识的深化，一系列针对这一过程的抗肾脏纤维化治疗也相继开展。Zeiberg等[30]为在肾脏纤维化形成过程中，局部RAS活化、TGF-β均能引起REPs激活转分化为MF。所以血管紧张素转换酶抑制剂、TGF-β及其发挥作用的下游结缔组织生长因子(CTGF)的阻滞剂或拮抗剂等抗肾脏纤维化治疗有可能从根本上改善肾功能，逆转肾脏纤维化[31]。其他的治疗靶点有ECM产生细胞、基因表观遗传调节(DNA甲基转移酶抑制剂)、免疫抑制剂(雷帕霉素、来氟米特)及改善细胞炎症微环境等也有复杂的相互作用，在逆转肾脏纤维化过程中起到一定作用[32]。

综上所述，REPs在肾脏纤维化过程中发挥着重要作用，已受到越来越多学者的关注，这为研究肾脏纤维化的机制开辟了新的领域。肾脏纤维化是多种肾病终末期的共同病变过程，肾脏纤维化程度与CKD患者肾功能恶化程度相关，因此阻断肾脏纤维化过程对CKD的治疗有重要意义。肾纤维化因毛细血管稀疏化和ECM过度积聚致氧输送减少，氧的需求增加，引起相对性低氧，因此REPs产生的EPO不但可以纠正CKD患者的贫血状态还能抑制肾脏纤维化的进展，延缓CKD向ESRD演化的进程。REPs转分化为肌成纤维细胞后，产生EPO的能力也相应降低。因此，阐明REPs在肾脏保护和肾脏纤维化形成中的作用及其机制，将为肾脏保护和抗肾脏纤维化治疗提供新的途径，具有十分重要的临床意义；研究REPs可塑性的生物学意义及其调控机制对于认识肾脏纤维化的规律及寻找逆转肾脏纤维化的方法有重要意义。体外培养REPs以及其合成EPO的能力将为MF-REPs恢复至正常REPs提供新的靶信号通路。研究和寻找防治肾纤维化的新靶标以及改进当前的治疗策略对进一步改善CKD的预后至关重要；对REPs进一步深入的研究无疑将对肾脏纤维化的发生机制和防治研究产生有益的影响。

1 Suzuki N.Erythropoietin gene expression:developmental-stage specificity,cell-type specificity,and hypoxia inducibility.Tohoku J Exp Med,2015,235(3):233-240.

2 Zeisberg M,Kalluri R.Physiology of the Renal Interstitium.Clin J Am Soc Nephrol,2015,10(10):1831-1840.

3 Remy I,Wilson IA,Michnick SW.Erythropoietin receptor activation by a ligand-induced conformation change.Science,1999,283(5404):990-993.

4 Miyake T,Kung CK,Goldwasser E.Purification of human erythropoietin.J Biol Chem,1977,252(15):5558-5564.

5 Bunn HF.Erythropoietin.Cold Spring Harb Perspect Med,2013,3(3):a011619.

6 Maxwell PH,Osmond MK,Pugh CW,et al.Identification of the renal erythropoietin-producing cells using transgenic mice.Kidney Int,1993,44(5):1149-1162.

7 Obara N,Suzuki N,Kim K,et al.Repression via the GATA box is essential for tissue-specific erythropoietin gene expression.Blood,2008,111(10):5223-5232.

8 Pan X,Suzuki N,Hirano I,et al.Isolation and characterization of renal erythropoietin-producing cells from genetically produced anemia mice.PLoS One,2011,6(10):e25839.

9 Suzuki N,Obara N,Yamamoto M.Use of gene-manipulated mice in the study of erythropoietin gene expression.Methods Enzymol,2007,435:157-177.

10 Yamazaki S,Souma T,Hirano I,et al.A mouse model of adult-onset anaemia due to erythropoietin deficiency.Nat Commun,2013,4:1950.

11 Souma T,Yamazaki S,Moriguchi T,et al.Plasticity of renal erythropoietin-producing cells governs fibrosis.J Am Soc Nephrol,2013,24(10):1599-1616.

12 Fried W,Kilbridge T,Krantz S,et al.Studies on extrarenal erythropoietin.J Lab Clin Med,1969,73(2):244-248.

13 Goldberg MA,Glass GA,Cunningham JM,et al.The regulated expression of erythropoietin by two human hepatoma cell lines.Proc Natl Acad Sci U S A,1987,84(22):7972-7976.

14 Pagel H,Jelkmann W,Weiss C.Erythropoietin production in the isolated perfused kidney.Biomed Biochim Acta,1990,49(2-3):271-274.

15 Dimke H,Sparks MA,Thomson BR,et al.Tubulovascular cross-talk by vascular endothelial growth factor a maintains peritubular microvasculature in kidney.J Am Soc Nephrol,2015,26(5):1027-1038.

16 Dewi FR,Fatchiyah F.Methylation impact analysis of erythropoietin(EPO)Gene to hypoxia inducible factor-1α(HIF-1α)activity.Bioinformation,2013,9(15):782-787.

17 Souma T,Suzuki N,Yamamoto M.Renal erythropoietin-producing cells in health and disease.Front Physiol,2015,6:167.

18 Koury ST,Koury MJ,Bondurant MC,et al.Quantitation of erythropoietin-producing cells in kidneys of mice by in situ hybridization:correlation with hematocrit,renal erythropoietin mRNA,and serum erythropoietin concentration.Blood,1989,74(2):645-651.

19 Eckardt KU,Koury ST,Tan CC,et al.Distribution of erythropoietin producing cells in rat kidneys during hypoxic hypoxia.Kidney Int,1993,43(4):815-823.

20 Quaggin SE,Kapus A.Scar wars:mapping the fate of epithelial-mesenchymal-myofibroblast transition.Kidney Int,2011,80(1):41-50.

21 Kuma A,Tamura M,Otsuji Y.Mechanism of and therapy for kidney fibrosis.J UOEH,2016,38(1):25-34.

22 Muchaneta-Kubara EC,el Nahas AM.Myofibroblast phenotypes expression in experimental renal scarring.Nephrol Dial Transplant,1997,12(5):904-915.

23 Boor P,Floege J.The renal(myo-)fibroblast:a heterogeneous group of cells.Nephrol Dial Transplant,2012,27(8):3027-3036.

24 Mack M,Yanagita M.Origin of myofibroblasts and cellular events triggering fibrosis.Kidney Int,2015,87(2):297-307.

25 Humphreys BD,Lin SL,Kobayashi A,et al.Fate tracing reveals the pericyte and not epithelial origin of myofibroblasts in kidney fibrosis.Am J Pathol,2010,176(1):85-97.

26 Kramann R,Schneider RK,DiRocco DP,et al.Perivascular Gli1+ progenitors are key contributors to injury-induced organ fibrosis.Cell Stem Cell,2015,16(1):51-66.

27 Zeisberg M,Hanai J,Sugimoto H,et al.BMP-7 counteracts TGF-beta1-induced epithelial-to-mesenchymal transition and reverses chronic renal injury.Nat Med,2003,9(7):964-968.

28 Schwartz DI,Pierratos A,Richardson RM,et al.Impact of nocturnal home hemodialysis on anemia management in patients with end-stage renal disease.Clin Nephrol,2005,63(3):202-208.

29 Nasri H.Renal Cell Protection of Erythropoietin beyond Correcting The Anemia in Chronic Kidney Disease Patients.Cell J,2014,15(4):378-380.

30 Zeisberg M,Strutz F,Müller GA.Role of fibroblast activation in inducing interstitial fibrosis.J Nephrol,2000,13(Suppl 3):s111-120.

31 Li J,Zhang Z,Wang D,et al.TGF-beta 1/Smads signaling stimulates renal interstitial fibrosis in experimental AAN.J Recept Signal Transduct Res,2009,29(5):280-285.

32 Farris AB,Colvin RB.Renal interstitial fibrosis:mechanisms and evaluation.Curr Opin Nephrol Hypertens,2012,21(3):289-300.

Erythropoietin-producingcellsandrenalfibrosis

SHAOFang,XIEHonglang

NationalClinicalResearchCenterofKidneyDiseases,JinlingHospital,NanjingUniversitySchoolofMedicine,Nanjing210016,China

The cells which produced erythropoietin (EPO) in kidney is called renal EPO-producing cells (REPs). Insufficient production of EPO can cause renal anemia and anemia associated with chronic disease disorders. REPs transformed into scar-forming myofibroblasts, resulting in renal fibrosis, chronic kidney disease (CKD) patients the EPO-producing ability of myofibroblast-transformed REPs (MF-REPs) is decreased. Recently studies on REPs made great progress and the research is expected to become the treatment of renal anemia and renal interstitial fibrosis new target.

erythropoietin EPO-producing cells Renal Fibrosis

2016-04-19

(本文编辑 凡 心 青 松)

10.3969/j.issn.1006-298X.2017.05.017

南京大学医学院附属金陵医院(南京总医院)硕士研究生(邵 芳) 国家肾脏疾病临床医学研究中心 全军肾脏病研究所(南京，210016)