新柏氏细胞清洗液在血性胸腹水细胞学诊断中的应用

朱启淦,孟加榕,禹 乐,戴太监,杨立民,陈艺锦,耿月华

(中国人民解放军第一七五医院,厦门大学附属东南医院病理科,漳州 363000;*通讯作者,E-mail:mengjiarong@ sina.com)

新柏氏细胞清洗液在血性胸腹水细胞学诊断中的应用

朱启淦,孟加榕*,禹 乐,戴太监,杨立民,陈艺锦,耿月华

(中国人民解放军第一七五医院,厦门大学附属东南医院病理科,漳州 363000;*通讯作者,E-mail:mengjiarong@ sina.com)

目的 探讨新柏氏细胞清洗液在血性胸腹水脱落细胞学检测中的应用及意义。 方法 收集我院2016-12～2017-04血性胸腹水130例,用新柏氏细胞清洗液处理后行液基细胞学制片(TCT)、细胞块切片联合免疫细胞化学检测;传统检测法未用新柏氏细胞清洗液处理,直接离心涂片及细胞块切片检测。 结果 130例血性胸腹水传统检测法涂片及细胞块切片中细胞重叠明显,常成堆分布,因含大量红细胞、蛋白黏液,造成背景不清晰;用新柏氏细胞清洗液处理后TCT及细胞块切片中红细胞数量与传统检测法相比明显减少,且间皮细胞、肿瘤细胞、淋巴细胞等轮廓清楚,细胞染色清晰。130例血性胸腹水标本传统细胞涂片肿瘤细胞检出率为16.15%(21/130),TCT法肿瘤细胞检出率为29.23%(38/130),两种方法HE染色结果差异有统计学意义(P<0.05);细胞块切片结合免疫细胞化学法肿瘤细胞检出率为36.15%(47/130),与TCT阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 血性胸腹水经新柏氏细胞清洗液去红细胞、黏液及蛋白液等处理,并采用TCT法及细胞块切片联合免疫细胞化学法能有效提高肿瘤细胞的检出率。

血性胸腹水; 液基细胞学; 细胞块; 免疫细胞化学

脱落细胞学检查是临床诊断肿瘤的重要方法之一,但血性胸腹水在细胞学标本制片过程中,由于标本中含有大量红细胞,使涂片及细胞块切片被红细胞覆盖,给细胞学诊断带来困难,特别是含血细胞较多而癌细胞又很少时,红细胞会将很少的癌细胞掩盖,致使细胞学诊断造成漏诊[1,2]。氯化铵、十六烷基三甲基溴化铵[1,2]等可消除红细胞,但在消除黏液、蛋白液时效果较差。而传统的血性胸腹水细胞涂片较难为临床提供肿瘤的准确来源及分型[3],免疫细胞化学染色效果也令人不满意[4]。为了提高血性胸腹水细胞学阳性检出率,我科经过反复实验,采用新柏氏细胞清洗液对血性标本进行处理,可以达到溶血、去黏液及蛋白液等效果,并采用TCT制片及细胞块切片联合免疫细胞化学法,红细胞数量明显减少,肿瘤细胞显示更加清晰,消除了背景模糊的现象,从而提高了血性胸腹水标本中肿瘤细胞的检出率,对细胞学诊断具有较高的使用价值及意义。

1 材料与方法

1.1 材料

收集我院2016-12～2017-04临床送检血性胸腹水130例,其中胸水95例,腹水35例。

1.2 仪器与试剂

400C医用低速离心机(北京白洋医疗器械有限公司),Thinprep 2000(美国新柏氏),RM2245切片机(德国莱卡),Leica ST5020染色机,Leica CV5030封片机, 免疫组化一抗CK7、TTF-1、CK5/6、P63、CD56、Syn、Calretinin、WT-1、NapsinA、CDX-2、CA-125、ER等及二抗试剂盒(羊抗鼠/兔)均购于福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标本预处理 新鲜血性胸腹水标本静置30 min,去除上清液,留取近瓶底液体约100 ml,混匀后取标本12 ml于4支15 ml尖端离心管内,2 000 r/min离心[5,6]5 min,去除上清液(若沉淀物少,重复离心),备用。

1.3.2 传统的血性胸腹水细胞学检测 取2支预处理离心管,一支沉淀物直接涂片,95%酒精固定,HE染色;一支加4%中性甲醛[7]12 ml混匀固定,静置30 min,2 000 r/min离心5 min,弃甲醛液,将沉淀物用滤纸包裹后放入包埋盒进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋制成细胞块,HE染色;观察涂片及细胞块切片细胞分布及背景清晰度,若发现可疑肿瘤细胞或肿瘤细胞行免疫细胞化学检测。

1.3.3 新柏氏细胞清洗液处理标本检测 取2支预处理离心管,加入新柏氏细胞清洗液12 ml,1 500 r/min振荡10 min,使离心管底部沉淀物分散、溶解直至颜色变浅红,2 000 r/min离心5 min,去除上清液。一支加新柏氏细胞保存液12 ml,混匀后转移至新柏氏样本瓶,静置15 min,使用新柏氏2000自动行TCT制片,HE染色;一支加4%中性甲醛12 ml混匀固定,静置30 min,2 000 r/min离心5 min,弃甲醛液,将沉淀物用滤纸包裹后放入包埋盒进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋制成细胞块,HE染色;观察涂片及细胞块切片细胞分布及背景清晰度,若发现可疑肿瘤细胞或肿瘤细胞行免疫细胞化学检测。

1.3.4 免疫细胞化学法 采用免疫细胞化学MaxVisionTM法染色。细胞块切片,65 ℃烤片40 min,脱蜡至水,PBS清洗3次,高温高压抗原修复,3% H2O2封闭10 min,PBS清洗3次,分别滴加一抗4 ℃冰箱过液,PBS清洗3次,每张切片加二抗试剂室温下孵育15 min,DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,封片。用已知细胞学阳性标本细胞块切片做阳性对照及PBS取代一抗做阴性对照。

1.3.5 结果判断 由诊断医生对HE及免疫细胞化学结果进行判读。HE镜下肿瘤细胞有明显的异型性,呈腺泡、腺管或团状排列,有的单个散在,核大深染;免疫细胞化学鳞癌CK5/6、P63、P40阳性,腺癌CK7、TTF-1、NapsinA阳性,小细胞癌CD56、Syn、TTF-1阳性,间皮细胞Calretinin、WT-1、CK5/6阳性。

1.4 统计学方法

采用SPSS17.0软件进行分析,不同方法肿瘤细胞检出率用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血性胸腹水检测结果

传统检测法:血性胸腹水涂片厚薄不均,细胞重叠明显,常成堆分布,因含大量红细胞、蛋白黏液,造成背景不清晰(图A1);细胞块切片及免疫细胞化学染色法细胞成堆或散在分布,背景不够清晰,免疫细胞化学因含大量红细胞、蛋白黏液,造成背景浅棕色,阳性定位模糊,影响结果判读(图B1、C1)。

新柏氏细胞清洗液处理后检测法:TCT中红细胞数量明显减少,肿瘤细胞、间皮细胞、淋巴细胞等轮廓清楚(图A2),细胞块切片及免疫细胞化学染色法细胞分布均匀,染色鲜艳,核质对比清晰,免疫细胞化学染色定位清晰准确(图B2、C2),效果明显优于传统检测法。

A1.涂片背景红染,癌细胞结构显示不清;B1.细胞块切片背景红染,癌细胞结构显示不清;C1.细胞块切片癌细胞CK7胞质表达,定位较模糊;A2.TCT背景清晰,癌细胞结构显示清楚;B2.细胞块切片背景清晰,癌细胞散在、团状分布;C2.细胞块切片癌细胞CK7胞质表达,定位准确图1 传统检测法与新柏氏细胞清洗液处理后血性胸腹水检测结果对比 (×200)

2.2 不同方法肿瘤细胞检出率比较

130例血性胸腹水标本传统细胞学涂片肿瘤细胞检出率为16.15%(21/130),TCT法肿瘤细胞检出率为29.23%(38/130),两种方法HE染色结果差异有统计学意义(P<0.05);细胞块切片结合免疫细胞化学法肿瘤细胞检出率为36.15%(47/130),与TCT阳性率比较差异无统计学意义(P>0.05,见表1),但TCT对一些可疑细胞、肿瘤细胞的来源及肿瘤分型无法确定,在加做细胞块联合免疫细胞化学后,可以判断类型及来源。

表1血性胸腹水不同方法检测结果比较

检测方法n阳性阴性可疑阳性阳性确认率(%)传统涂片法13021931616.15TCT法1303887529.23*细胞块免疫组化法1304783036.15

TCT法与传统细胞学涂片法比较,*P<0.05;细胞块免疫组化法与TCT法比较,P>0.05

3 讨论

胸腹水脱落细胞学常规涂片检查恶性肿瘤细胞因具有快速、准确、简便、易行以及患者痛苦少等优点,在临床上得以广泛应用。然而脱落细胞学检查中HE涂片质量是制约其阳性检出率的关键因素之一,加强涂片制片过程的质控,引用新制片技术(如TCT的应用及细胞块的制备),可显著提高其阳性检出率和分型诊断的准确性[8],且在日常细胞学标本制片中,常有血性胸腹水标本,传统涂片法因存在大量血液和蛋白液[9],造成涂片厚薄不均,细胞重叠,染色效果不佳,常致涂片在染色水洗过程中掉片,使观察结果受到限制和影响,干扰了脱落细胞学的诊断。由于红细胞的大量存在,会掩盖部分肿瘤细胞,极易造成漏诊或误诊。我科经过反复试验,采用新柏氏细胞清洗液对血性胸腹水进行溶血、去黏液及蛋白液等处理,再结合TCT法制片,发现涂片中红细胞量明显减少,肿瘤细胞相对集中,分布均匀,形态清晰,明显提高血性胸腹水中肿瘤细胞的检出率。

TCT法制片也有缺点,如反应性增生或退变的间皮细胞与某些肿瘤细胞尤其是腺癌细胞在形态上相似, 以及恶性肿瘤细胞的分型仅靠细胞形态学很难做出正确的诊断,且恶性肿瘤在组织形态上时常无法区分其来源和发生部位,因此我科联合胸腹水沉渣石蜡包埋切片法。该法因多次离心而增加了细胞数量,切片上细胞更加集中,而且细胞结构更加清晰。细胞块制成后可以连续切片,避免了单一涂片取材的局限性。与常规组织切片相比,无明显差异,可根据诊断及研究需要开展类似组织学的各种检查[10],并能长期保存。与涂片及TCT相比,不会出现掉片,使染色定位准确、可靠,背景清晰,易于作出准确诊断,可得到相对一致的细胞学切片[11],弥补TCT制片的不足。

血性胸腹水在检测过程中,需要注意以下事项:①标本30 min内送检，60 min内完成标本处理和固定为脱落细胞学检查的必要条件, 增加送检次数可提高肿瘤细胞检出率。②离心后需用吸管轻轻吸去上清液，勿用倾倒法。③血性胸腹水中红细胞含量高，可在新柏氏细胞清洗液中适当增加冰乙酸量。④细胞块固定液的选择，使用4%中性甲醛切片定位准确、稳定性强，且重复性高。⑤胸腹水沉渣提取时，离心力选用2 000 r/min，能有效权衡细胞数量与细胞损伤程度。

综上所述,血性胸腹水经过溶血、去黏液及蛋白液等处理,并采用TCT制片及细胞块的制备结合形态学、免疫细胞化学等诊断技术的联合应用,可使阳性检出率大大提高,同时其细胞学诊断还可以用于判断肿瘤的来源部位、分型、分期甚至评估预后等,为临床诊治提供重要依据[12-14],值得在实验室推广应用。

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R446

A

1007-6611(2017)10-1079-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.023

中国人民解放军第一七五医院青年苗圃基金资助项目(16Y020)

朱启淦,男,1988-03生,学士,主管技师,E-mail:694095459@qq.com

2017-06-01