miR-1202在宫颈癌组织中的表达及对HeLa细胞增殖及凋亡的影响

姚婷婷,张红娜,高 婉,朱 康,段 钊

(西安交通大学第二附属医院妇产科,西安 710004;*通讯作者,E-mail:duanzhao8@163.com)

miR-1202在宫颈癌组织中的表达及对HeLa细胞增殖及凋亡的影响

姚婷婷,张红娜,高 婉,朱 康,段 钊*

(西安交通大学第二附属医院妇产科,西安 710004;*通讯作者,E-mail:duanzhao8@163.com)

目的 探讨miR-1202在宫颈癌组织中的表达及其对宫颈癌HeLa细胞增殖及凋亡的影响。 方法 采用实时定量PCR检测29例宫颈癌组织及相对应的癌旁正常组织中miR-1202的表达;构建miR-1202过表达载体及合成miR-1202抑制剂,并转染宫颈癌HeLa细胞;HeLa细胞被随机分为4组:对照组(miR-control)、miR-1202过表达载体组(miR-1202)、miR-1202抑制剂阴性对照组(Inhibitor NC)、miR-1202抑制剂组(miR-1202 inhibitor);MTT法检测miR-1202对宫颈癌细胞增殖的影响;流式细胞术分析miR-1202对细胞周期和凋亡的影响。 结果 miR-1202在宫颈癌组织中的表达显著下调(P<0.01);miR-1202过表达载体组与miR-control组相比,OD值显著降低(P<0.01),G1/G0期细胞数显著增加(84.63%±5.08%;P<0.01),S期(11.56%±2.51%)和G2/M期(4.62%±1.75%)细胞数显著减少(P<0.01),早期凋亡(19.68%±2.66%)和晚期凋亡(10.89%±1.94%)细胞数均显著增加(P<0.01);而miR-1202 inhibitor组与Inhibitor NC组相比,OD值显著升高(P<0.01),G1/G0期细胞数量显著减少(43.68%±4.86%;P<0.01),S期(38.94%±2.86%)和G2/M期(18.65%±1.82%)细胞数量显著增加(P<0.01),早期凋亡(2.06%±1.33%)和晚期凋亡(2.85%±1.22%)细胞数均显著减少(P<0.01)。 结论 miR-1202在宫颈癌组织中下调,可抑制宫颈癌HeLa细胞的增殖,并诱导细胞凋亡。

miR-1202; 宫颈癌; 细胞增殖; 细胞周期; 细胞凋亡

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤,为女性癌症死亡的首要原因,全球每年约30万人死于宫颈癌[1],其发病率在女性癌症中位于第2位,死亡率位于第5位[2]。近年来,宫颈癌的发病呈年轻化趋势,严重威胁女性的健康。宫颈癌的发生发展是一个由多基因、多因素调控的多阶段的极其复杂过程。目前关于宫颈癌的发病机制仍未完全阐明。研究表明核酸水平的调控与宫颈癌的发生发展关系密切,尤其是非编码微小RNA(microRNA,miRNA)通过靶向调控其靶基因的表达影响宫颈癌发生发展。miRNA是一类长度为18-25个核苷酸、具有高度保守性的非编码单链小分子RNA,它通过调节靶基因的表达,可参与细胞增殖、凋亡、分化、迁移和侵袭等生物学过程。miRNA通过与靶基因的mRNA的3′端非翻译区互补性结合,抑制mRNA的翻译或直接降解mRNA从而导致靶基因的表达下调[3]。近来的研究发现miR-1202可抑制胶质瘤细胞增殖[4],而miR-1202在宫颈癌发生发展中的作用尚未见报道。本研究分析miR-1202在宫颈癌组织中的表达变化及其对宫颈癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞株及病理组织

人宫颈癌细胞系HeLa由西安交通大学第二附属医院转化医学中心提供。收集2016-01～2016-11西安交通大学第二附属医院外科手术切除的宫颈癌组织及相应的癌旁正常组织29例,手术后均经病理检查确认,所有患者手术前均未经化疗、放疗等治疗,收集样本后置于液氮中长期保存。采集前经过医院伦理委员会批准及患者知情同意。

1.2 主要仪器与试剂

CO2培养箱(英国RS Biotech公司);-80 ℃冰箱(日本SANYO公司);高通量微板测试系统(德国BMG Labtechnologies公司);流式细胞仪(美国FALS CALIBAR BD公司);实时定量PCR仪(美国Bio—Rad公司,iQ5 Multicolor)。RPMI 1640培养基(美国Gibco公司);新生胎牛血清(美国Gibico公司);MTT、RnaseA、碘化丙啶(美国Sigma公司);Annexin Ⅴ-FITC凋亡试剂盒(美国BD BioScience公司);Trizol和Lipofectamine2000(美国Invitogen公司);qRT-PCR试剂盒和逆转录试剂盒(大连TaKaRa公司)。

1.3 miR-1202过表达载体的构建及抑制剂的合成

在miRbase数据库查找miR-1202的前体序列(MI0006334,5′-CCUGCUGCAGAGGUGCCAGCUGCAGUGGGGGAGGCACUGCCAGGGCUGCCCACUCUGCUUAGCCAGCAGGUGCCAAGAACAGG-3′),并在两端构建EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位点,该序列由上海生工生物工程有限公司合成。将该序列克隆到真核表达载体pcDNA6.2-GW/EmGFP中,然后由上海生工生物工程有限公司克隆、筛选、测序鉴定。miR-1202 inhibitor(5′-CUCCCCCACUGCAGCUGGCAC-3′)和miR-1202 inhibitor阴性对照(Inhibitor NC,5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′)由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 细胞培养与转染

人宫颈癌细胞系HeLa细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基,5% CO2,37 ℃培养,将对数生长期的HeLa细胞进行实验。实验分组为:pcDNA6.2空载体为对照组(miR-control)、miR-1202过表达载体组(miR-1202)、miR-1202抑制剂阴性对照组(Inhibitor NC)、miR-1202抑制剂组(miR-1202 inhibitor)。细胞在培养24 h时,各组依照Lipofectamine2000转染说明书瞬时转染。

1.5 实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

在临床宫颈癌样本组织、癌旁正常组织、HeLa细胞中加入Trizol,用氯仿、异丙醇等提取总RNA。取1 μ1总RNA,分别加入特异性茎环引物(内参U6-RT:5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;miR-1202-RT:5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACGG GGGAG-3′),依照试剂盒说明书操作逆转录cDNA,反应温度:42 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。qRT-PCR反应,按照序列设计引物。内参U6引物Forward: 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,U6引物Reverse: 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;miR-1202引物Forward: 5′-ATCCAGTGCGT GTCGTG-3′,Reverse: 5′-TGCTGTGCCAGCTGCAGT-3′。扩增条件:95 ℃变性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,40个循环,72 ℃延伸5 min终止反应。所有样品均设立3个复孔,并用2-ΔΔCt法对结果进行相对定量分析。

1.6 MTT法检测HeLa细胞增殖

HeLa细胞以4 000个/孔接种于96孔板,培养基为200 μl/孔。每组4个复孔,转染miR-1202过表达载体和抑制剂后培养24,48,72 h,每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl,再培养4 h,弃上清液,加入150 μl DMSO,震荡,用微板测试仪检测光吸收值,波长为490 nm。

1.7 流式细胞仪检测HeLa细胞周期

转染48 h时收集细胞,每组3个复孔,用预冷的PBS洗涤3次,75 %乙醇过夜固定;加浓度为100 μg/ml碘化丙啶(PI)染液0.3 ml,室温静置15 min;流式细胞仪检测,激发波长是488 nm,PI的红色荧光通过630 nm的滤光片进行信号收集,利用Modfit LT软件分析DNA含量变化,并分析细胞周期变化。

1.8 流式细胞仪检测HeLa细胞凋亡

收集转染48 h的细胞,每组3个复孔,用预冷的PBS洗涤3次。500 μl结合缓冲液悬浮细胞,加入5 μl Annexin Ⅴ/FITC和5 μl 20 μg/ml的PI,混匀,室温静置15 min。流式细胞仪检测,FITC发绿色荧光,PI受激发后发红色荧光,检测结果用随机软件进行分析。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 miR-1202在宫颈癌组织中的表达

采用qRT-PCR检测29对宫颈癌组织及癌旁正常组织miR-1202的表达变化。结果显示,与癌旁正常组织相比,miR-1202在宫颈癌组织中表达显著下调(P<0.01),平均下调至正常组织的0.61倍(见图1)。

图1 miR-1202在宫颈癌组织中表达Figure 1 The miR-1202 expression in cervical cancer tissues

2.2 miR-1202对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

在宫颈癌细胞系HeLa细胞中分别转染空载体(miR-control)、miR-1202过表达载体(miR-1202)、抑制剂阴性对照(Inhibitor NC)、miR-1202抑制剂(miR-1202 inhibitor),并在转染24 h时通过qRT-PCR检测miR-1202表达。结果显示,与miR-control组相比,miR-1202过表达载体组miR-1202表达显著上调(P<0.01),上调至36.8倍;而转染抑制剂后miR-1202表达无显著变化(见表1)。MTT法分析miR-1202对宫颈癌细胞系HeLa细胞增殖能力的影响。结果表明,与miR-control组相比,转染miR-1202过表达载体48,72 h时OD值(0.498±0.045,0.685±0.062)均显著降低(P<0.01);与Inhibitor NC组相比,转染miR-1202 inhibitor 48,72 h时OD值(0.806±0.058,1.201±0.073)均显著升高(P<0.01，见图2),说明miR-1202可抑制宫颈癌细胞系HeLa细胞增殖。

组别 miR-1202表达P* miR-control组1 miR-1202组36.82±2.110.001 InhibitorNC组1 miR-1202inhibitor组0.93±0.100.873

*与上一组比较P值

与miR-control组相比,*P<0.01;与inhibitor NC组相比,#P<0.01图2 MTT比色分析miR-1202对HeLa细胞增殖的影响Figure 2 Effect of miR-1202 on the HeLa cell proliferation by MTT assay

2.3 miR-1202对宫颈癌HeLa细胞周期的影响

在HeLa细胞中分别转染miR-1202过表达载体和miR-1202 Inhibitor 48 h时,收集细胞分散为单细胞悬液,流式细胞仪检测细胞周期。miR-1202过表达载体组与miR-control组相比,G1/G0期细胞数量显著增加(84.63%±5.08%,P<0.01),而S期细胞数量显著减少(11.56%±2.51%,P<0.01),G2/M期细胞数量也显著减少(4.62%±1.75%,P<0.01);miR-1202 Inhibitor组与Inhibitor NC组相比,G1/G0期细胞数量显著减少(43.68%±4.86%,P<0.01),S期细胞数量显著增加(38.94%±2.86%,P<0.01),G2/M期细胞数量也显著增加(18.65%±1.82%,P<0.01,见图3)。结果证明miR-1202可使宫颈癌HeLa细胞阻滞在G0/G1期,从而抑制细胞进入S和G2/M期进行增殖。

与miR-control组相比,*P<0.01;与Inhibitor NC组相比,#P<0.01图3 miR-1202对HeLa细胞周期的影响Figure 3 Effect of miR-1202 on the cell cycle of HeLa cells

2.4 miR-1202对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响

HeLa细胞分别转染miR-1202过表达载体和miR-1202 Inhibitor 48 h时,收获细胞制备单细胞悬液,采用Annexin Ⅴ+PI试剂盒染色,流式细胞仪检测分析。与miR-control组相比,miR-1202过表达载体组早期凋亡细胞显著增加(19.68%±2.66%,P<0.01),晚期凋亡细胞也增加(10.89%±1.94%,P<0.01);与Inhibitor NC组相比,miR-1202 Inhibitor组早期凋亡细胞显著减少(2.06%±1.33%,P<0.05),晚期凋亡细胞也减少(2.85%±1.22%,P<0.01,见图4)。这表明miR-1202可诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡。

与miR-control组相比,*P<0.01;与Inhibitor NC组相比,#P<0.01图4 miR-1202对HeLa细胞凋亡的影响Figure 4 Effect of miR-1202 on the apoptosis of HeLa cells

3 讨论

在宫颈癌的研究中发现,多种miRNA的表达异常与宫颈癌的发生、发展以及预后等关系密切,例如,miR-182、miR-21、miR-361-5p和miR-92等在宫颈癌中高表达,发挥癌基因的作用[5,6];而miR-101和miR-7等miRNA在宫颈癌中的表达明显下调,发挥抑癌基因的作用[7]。研究报道,miR-7可通过靶向调控环氧合酶2和X连锁凋亡抑制蛋白等基因的表达抑制宫颈癌细胞的增殖、侵袭及迁移,并诱导凋亡[7]。下调miR-21可通过上调CCL20抑制细胞增殖、迁移,促进凋亡,并抑制裸鼠宫颈癌皮下移植瘤的生长;而过表达miR-21可通过抑制PTEN来促进宫颈癌细胞的增殖及迁移[8]。近来的研究发现miR-1202参与了几种肿瘤的发生发展,但是miR-1202在不同肿瘤中的表达变化并不相同,其原因可能是在不同肿瘤中的作用机制不同。例如,miR-1202在卵巢癌、胶质瘤和透明细胞乳头状肾细胞癌中表达下调[4,9,10],而在子宫内膜癌、乳腺癌、胃癌、肾上腺皮质癌和甲状腺乳头状癌中表达上调[11-14]。本研究结果表明,miR-1202在宫颈癌中的表达显著减少,提示其可能在宫颈癌的发生发展中发挥抑制作用。

miR-1202的生物学功能中,主要涉及的是调节肿瘤细胞增殖与凋亡的功能。在不同肿瘤的发生发展过程中,miR-1202可能作为癌基因存在,也可能作为抑癌基因发挥功能。Quan等[4]发现miR-1202在胶质瘤中通过靶向调控Rab1A诱导内质网应激和凋亡,并抑制胶质瘤细胞增殖。Özata等[13]研究表明高表达的miR-1202与肾上腺皮质癌的生存率密切相关。Wang等[14]报道高表达的miR-1202与肾上腺皮质癌的淋巴结转移相关。本研究表明,miR-1202可抑制宫颈癌HeLa细胞增殖,使宫颈癌细胞阻滞在G0/G1期,并诱导凋亡。

综上所述,miR-1202在宫颈癌组织中表达显著下调,抑制宫颈癌细胞的增殖,阻断细胞周期,并诱导细胞凋亡,由此可见miR-1202在宫颈癌中起着抑癌基因的作用。这将为寻找宫颈癌新的分子治疗靶标提供实验依据,但是miR-1202在宫颈癌发生发展过程中的分子作用机制有待于进一步探索。

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作者来信摘登

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山西医科大学第二医学院 张秦风

ExpressionofmiR-1202incervicalcancertissuesanditseffectonproliferationandapoptosisofHeLacells

YAO Tingting, ZHANG Hongna, GAO Wan, ZHU Kang, DUAN Zhao*

(DepartmentofObstetricsandGynecology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;*Correspondingauthor,E-mail:duanzhao8@163.com)

ObjectiveTo investigate the expression of miR-1202 in human cervical cancer tissues and its effects on proliferation and apoptosis of HeLa cells.MethodsThe qRT-PCR was used to detect the expression of miR-1202 in 29 cases of cervical cancer samples and control tissues. MiR-1202 overexpression vector was constructed. MiR-1202 inhibitor was synthesized. MiR-1202 overexpression vector and miR-1202 inhibitor were transfected into HeLa cells. HeLa cells were divided into four groups: control group(miR-control), miR-1202 overexpression vector group(miR-1202),miR-1202 inhibitor negative control group(inhibitor NC) and miR-1202 inhibitor group(miR-1202 inhibitor). MTT assay was used to analyze the effects of miR-1202 on proliferation of cervical cancer HeLa cells. The effects of miR-1202 on the cell cycle and apoptosis of cervical cancer HeLa cells were observed by flow cytometer.ResultsThe expression of miR-1202 significantly down-regulated in cervical cancer tissues(P<0.01). Compared with miR-control, miR-1202 overexpression vector decreased the OD value(P<0.01), increased the proportion of G1/G0phase cells(84.63%±5.08%,P<0.01), reduced the proportion of S and G2/M phase cells (11.56%±2.51% and 4.62%±1.75%,P<0.01), and increased the proportion of early apoptosis and late apoptosis (19.68%±2.66% and 10.89%±1.94%,P<0.01). Compared with inhibitor NC, miR-1202 inhibitor increased the OD value(P<0.01), diminished the proportion of G1/G0phase cells (43.68%±4.86%,P<0.01), increased the proportion of S and G2/M phase cells (38.94%±2.86% and 18.65%±1.82%,P<0.01), and reduced the proportion of early apoptosis and late apoptosis(2.06%±1.33% and 2.85%±1.22%,P<0.01).ConclusionThe expression of miR-1202 decreases in cervical cancer tissues, and it can inhibit the proliferation of cervical cancer cells and induce the apoptosis.

miR-1202; cervical cancer; cell proliferation; cell cycle; cell apoptosis

R737.33

A

1007-6611(2017)10-1008-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.007

陕西省自然科学基金资助项目(2013JM4012)

姚婷婷,女,1987-04生,在读硕士,住院医师,E-mail:yaott415@sina.com

2017-06-09