附子、黄连寒热药性对体外足细胞增殖及TRPV4、TRPC6蛋白表达的影响

王 竹，孙万森，李 欣，李睿萍

(西安交通大学第二附属医院中医科，西安 710004)

附子、黄连寒热药性对体外足细胞增殖及TRPV4、TRPC6蛋白表达的影响

王 竹，孙万森，李 欣，李睿萍

(西安交通大学第二附属医院中医科，西安 710004)

目的 研究附子、黄连寒热药性对体外足细胞增殖及TRPV4、TRPC6蛋白表达的影响。 方法 MTT法检测足细胞增殖，实验分为：空白对照组、附子组和黄连组。附子组和黄连组加入不同浓度药液进行干预，并测定吸光值(A)，计算细胞抑制率。检测TRPV4、TRPC6蛋白试验中，实验分为：空白对照组、附子组和黄连组，其中附子组给予200 μg/ml药液、黄连组给予800 μg/ml药液，再加入含RPMI 1640培养基培养足细胞24 h。用Western blot法检测附子、黄连对TRPV4、TRPC6蛋白表达影响。 结果 MTT的研究表明，黄连组中50，100，200，400，800 μg/ml药液均可抑制足细胞生长增殖，且与浓度成正相关。附子在相对较低的质量浓度范围内(<200 μg/ml)，促进足细胞生长增殖，超过一定实验浓度时(>200 μg/ml)，抑制足细胞生长增殖。实验表明附子和黄连均可以上调TRPV4蛋白表达，与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。而在TRPC6蛋白表达中，附子和黄连具有明显的下调TRPC6蛋白表达的作用，与空白对照组对比差异有统计学意义(P<0.05)。 结论 附子、黄连这两种不同药性的中药均可以影响与肾脏病相关的蛋白TRPV4、TRPC6表达。

寒热药性； TRPV4； TRPC6

中药的四性，即药物寒、热、温、凉之性，反映药物作用于人体寒热变化的影响，是中药临床运用的核心。寒、热、温、凉虽属性不同，凉次于寒，温次于热，但寒、凉同属一种，温、热可归为一类，所以大体还是可以归纳为寒、热两性，寒热药性可作为中药主要的药物属性。温热性质的中药代表药物“性热”的特点，用于治疗寒证；寒凉性质的中药代表药物“性寒”的属性，主要针对于热证甚或火毒之证。研究发现，温热药总属兴奋、向上作用，可以在不同程度上增强、提高机体的多种生理功能，寒凉药总归于抑制、向下效应，在不同水平发挥着减弱、缓慢机体的生理功能和多种酶活性作用[1]。

瞬时受体电位通道(transient receptor potential channel，TRP)是位于细胞膜上外周和中枢神经系统广泛分布的一类阳离子通道，与Ca2+关系密切，由Cosens等[2]首次在黑腹果蝇的视觉传到系统中发现，产生瞬间、瞬时的峰值电位电流而得此名。TRP通道蛋白家族庞大、分布广泛，TRP是感受体系中的门控分子，对外部各种感觉刺激与神经系统进行联系的介质，对于外部的温度刺激、痛觉刺激等刺激可转换成为神经系统可感知的内向电流。近年来，已明确瞬时感受器电位通道在温度感觉中起重要作用，并且可以介导肾脏疾病[3]。本研究是基于对慢性肾脏疾病的研究，本实验中选择足细胞作为研究对象。足细胞是一种终末分化的上皮细胞，增生的能力是非常有限的，一旦破坏，很难再生。并且具有稳定的表型[4]，对于肾小球滤过膜功能与结构正常的维持起重要作用[5]。实验中选用具有温热药性的附子及寒凉药性的黄连，分别对体外肾小球足细胞抑制率、TRPV4(transient receptor potential vanilloid receptor 4)、TRPC6(transient receptor potential cation channel 6)蛋白作用，探讨温热药物及寒凉药物对肾脏疾病治疗的可能靶点及机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂

大鼠肾小球脏层上皮细胞(足细胞)，购自复旦IBS细胞资源库。RPMI1640培养基(Sigma公司，美国)，胎牛血清FBS(Sigma公司，美国)，重组小鼠γ-INF(Thermo公司，美国)，兔抗TRPC6多克隆抗体(Abcam公司，美国)，兔抗TRPV4多克隆抗体(Abcam公司，美国)HRP-羊抗兔IgG(博士德生物公司,中国)。

1.2 附子、黄连药液制备

附子、黄连，购于北京同仁堂药店。附子、黄连组各用20 g药物，煎煮前水浸泡30 min，分别煎2次，第1次2 h，第2次1.5 h，药液用纱布过滤，合并2次滤液，抽滤并浓缩定容至20 ml，质量浓度为1 g/ml。药液10 000 r/min离心30 min，上清液用0.22 μm的微孔滤膜滤过，无菌水稀释至10 mg/ml，灌入清洁玻璃容器内，封口，121 ℃高压蒸汽灭菌30 min，4 ℃保存备用。

1.3 足细胞培养

足细胞于33 ℃，5% CO2孵箱培养。在重组小鼠IFN-γ(150 U/ml)诱导条件下足细胞增殖，而在37 ℃不含IFN-γ的培养基中培养10 d，足细胞停止增殖，获得分化表型。

1.4 MTT法检测足细胞抑制率

实验分为以下3个处理组：空白对照组、附子组、黄连组。用0.25 %胰酶消化分化成熟的足细胞，使分散后以8 000/孔的密度接种于96孔板(每孔加入80 μl)，将培养体系用培养基补至100 μl/孔，边缘用培养基填充。接种好的细胞放入含5% CO2、37 ℃培养至细胞单层铺满孔底。各实验组加入含不同药物浓度的培养液20 μl，空白组则加入20 μl培养液，附子组和黄连组加入浓度为50，100，200，400，800 μg/ml药液，设6个复孔；放入培养箱继续培养24 h，每孔加入10 μl MTT溶液，继续培养4 h后终止培养，吸去上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜，置摇床振荡10 min，使结晶物充分溶解后，用酶标仪在波长490 nm下测定吸光值(A)值。实验重复3次。按下列公式计算细胞抑制率。抑制率为正值表示对细胞生长增殖有抑制作用，负值表示对细胞有促增殖作用[6]。细胞抑制率=(1-实验组A值/对照组A值)×100%

1.5 Western blot检测药物干预下TRPV4、TRPC6的表达

实验分为3组。空白对照组加入无血清RPMI-1640培养基培养足细胞48 h；附子组附子溶液(200 μg/ml)与足细胞预孵育50 min继续作用24 h，再加入含RPMI 1640培养基培养足细胞24 h；黄连组黄连(800 μg/ml)与足细胞预孵育50 min，再加入含RPMI 1640培养基培养足细胞24 h。

25 cm2培养瓶中的各组细胞以预冷的PBS液洗2次，加入100 μl预冷裂解液，冰浴5 min，刮勺收集样本，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清，以考马斯亮兰法测定提取蛋白浓度。每个样本取50 μg蛋白加入等体积2×SDS上样缓冲液煮沸变性后，上预制的10% SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，14 V×16 h湿法转移至硝酸纤维素膜。转载标本蛋白的硝酸纤维素膜浸入含5%脱脂奶粉的TTBS(20 mmol/L Tris-HC1，pH=7.4,150 mmol/L NaC1，10.1% Tween-20)，室温封闭1 h，参考一抗说明书，一抗稀释液分别稀释TRPV4、TRPC6和β-actin抗体，将膜置于封闭袋中，4 ℃孵育过夜；室温孵育1 h，充分洗涤后，用增强的化学发光系统，将胶片进行扫描照相后，使用凝胶图像处理系统分析目的条带的分子量和荧光密度值。应用ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。Ct值作为荧光实时定量的结果，以β-actin基因作为内参照，采用2-ΔΔCt计算处理的样品相对于未经处理样品的倍数变化。Western blot结果计算条带的积分光密度(optic density，OD)，进行半定量分析。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 MTT法测定最佳药物浓度及不同处理组足细胞活率

MTT结果分析表明，附子组附子浓度在50-200 μg/ml之间对于细胞增殖有促进作用，随着浓度的增加，出现对细胞增殖的抑制作用(见表1)；黄连组各实验浓度一直出现细胞增殖抑制作用，且与浓度成正相关(见表2)。确定对细胞增殖出现促进及抑制作用的最大浓度，即附子溶液200 μg/ml及黄连溶液800 μg/ml药物作为研究对象进行下面的Western实验。

组别 nA值 对照组61.24±0.0650μg/ml附子61.38±0.02100μg/ml附子61.35±0.07200μg/ml附子61.28±0.02400μg/ml附子61.12±0.07800μg/ml附子60.68±0.03*

与对照组比较，*P<0.05

组别 nA值 对照组61.24±0.0650μg/ml黄连60.24±0.01*100μg/ml黄连60.18±0.01*200μg/ml黄连60.16±0.02*400μg/ml黄连60.15±0.01*800μg/ml黄连60.10±0.02*

与对照组比较，*P<0.05

2.2 Western blot法测定不同处理组TRPV4蛋白表达情况

与空白对照组相对比，附子组及黄连组的TRPV4蛋白表达均升高，且与空白对照组比较差异有统计学意义(见图1)。

2.3 Western blot法测定不同处理组TRPC6蛋白表达情况

与空白对照组相比较，附子组及黄连组的TRPC6蛋白的表达下降，且与空白对照组比较差异有统计学意义(见图2)。

与空白对照组比较，*P<0.05图1 附子和黄连对TRPV4蛋白表达的影响 (n=6)Figure 1 Effect of Fuzi and Huanglian on expression of TRPV4 protein (n=6)

与空白对照组比较，*P<0.05图2 附子和黄连对TRPC6蛋白表达的影响 (n=6)Figure 2 Effect of Fuzi and Huanglian on expression of TRPC6 protein (n=6)

3 讨论

TRPV4是在细胞低渗肿胀状态时开放的通道蛋白，最早是作为低渗透压感受器而被研究的。TRPV4通道蛋白表达已被广泛研究，TRPV4广泛分布于神经、骨骼、心、肺、肾、睾丸、皮肤、血管等多种组织[7],在哺乳动物体内，尤其是哺乳动物的肾脏组织有TRPV4的同源体[8]。当大量表达于血管内皮细胞时，局部温度上升，该通道蛋白被激活，诱发Ca2+内流，可以引起局部血管的扩张。Lang等[9]研究发现，在TGF-β刺激作用下，表达迅速增加的血清糖皮质激素诱导激酶1(serum and glucocorticoid inducible kinase-1，SGK1)，能够诱导TRPV4通道蛋白的活化，促进Ca2+内流，从而参与肾纤维化的发生发展。因此，TRPV4可能通过Ca2+及不同信号通路调控肾纤维化发生发展。

研究显示，TRPC6是新近发现的足细胞裂孔隔膜蛋白之一，与足细胞其他裂孔隔膜蛋白存在相互作用，其对维持足突和裂孔隔膜功能、结构完整性和骨架结构、RhoA信号通路的传导起重要作用[10]。2007年范青锋等[11]从mRNA及蛋白水平证实了足细胞系(MPC5)表达TRPC6。当TRPC6过表达时足突出现回缩形态，同时钙离子内流，细胞内钙离子浓度升高，激动α-activation蛋白，细胞骨架重排[12]，致使足细胞不能维持正常生理功能，在动物模型则会出现蛋白尿。当TRPC6基因突变后，突变的基因编码的结构蛋白会导致进行性蛋白尿，最终发展成为慢性肾功能衰竭和局灶节段性肾小球硬化。Chi-Xiang等[13]在体外实验中，发现沙坦可以下调足细胞中Ang Ⅱ引起的TRPC6表达，从而减轻足细胞的损伤。由以上可见，TRPC6与肾脏疾病的发生确有一定的联系。

研究表明，在一定浓度范围内，热药可能会促进细胞生长、代谢、增殖，而寒药会表现为抑制[1]。本实验中，通过对足细胞抑制率MTT的研究发现，在一定质量浓度范围内，黄连抑制足细胞生长增殖，且与浓度成正相关。附子在相对较低的质量浓度范围内(<200 μg/ml)，促进足细胞生长增殖，当质量浓度增大到一定程度时，抑制足细胞生长增殖，与文献报道相同。在Western blot的实验中，选择具有促进及抑制最大效果的药物浓度，即附子溶液200 μg/ml及黄连溶液800 μg/ml作为研究对象。从蛋白水平来说，实验表明附子和黄连均可以上调TRPV4蛋白表达，与空白对照组相比差异有统计学意义。而在TRPC6蛋白表达中，附子和黄连具有明显的下调TRPC6蛋白表达的作用。以上结果表明，寒热药性不同的中药可以激活TRPV4、TRPC6蛋白通道。文献研究温度变化可以激活TRPV4、TRPC6蛋白通道[14-16]，本实验中是什么引起上述2个蛋白表达的变化呢？是否由于寒热药性不同的中药对于这两种蛋白具有类似温度激活的作用，附子体现为热激活，黄连可以理解为冷激活呢？本实验同时也说明，寒热药性不同的附子、黄连，对同一蛋白的表达并没有表现出相反的作用效果，即表现为对TRPV4蛋白同时上调表达及对TRPC6蛋白同时下调表达，说明无论寒、热药性，可能只要微观温度变化即可影响蛋白表达。当然，上述作用效果是否存在，并且是否存在于所有的寒热中药中，还需要进一步研究。

在慢性肾脏病的治疗过程中，根据患者的不同辨证，经常使用寒热药性不同的中药进行治疗。只要辨证准确，确能有一定的疗效，通过本实验，说明无论寒、热药性不同的中药，均对于与肾脏病相关的蛋白TRPV4、TRPC6表达有影响，希望为在肾脏病领域中中药药性的研究提供一定的思路及实验依据。

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EffectofFuziandHuanglianoninvitrocellproliferationandtheexpressionofTRPC6andTRPV4

WANG Zhu, SUN Wansen, LI Xin, LI Ruiping

(DepartmentofTraditionalChineseMedicine,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China)

ObjectiveTo explore the effects of Fuzi and Huanglian on podocyte proliferation and the expression of TRPV4 and TRPC6 proteinsinvitro.Methods①MTT method was used to detect the podocyte proliferation. The experiment was divided into blank control group, Fuzi group and Huanglian group. Different concentrations of Fuzi and Huanglian were used to treat the podocytes. The absorbance value(A) was measured, and the inhibition rate of cells was calculated. ②The experiment was divided into blank control group, Fuzi(200 μg/ml) group and Huanglian(800 μg/ml) group. The podocytes were given liquid medicine, and then cultured with RPMI 1640 medium for 24 h to detect the expression of TRPV4 and TRPC6 protein by Western blot.ResultsMTT results showed that 50, 100, 200, 400 and 800 μg/ml Huanglian inhibited the growth and proliferation of podocyte in a concentration-dependent manner. The relatively low concentration of Fuzi (<200 μg/ml) promoted the growth and proliferation of podocytes, while the relatively high concentration(>200 μg/ml) inhibited the growth and proliferation of podocytes. The results showed that the expression of TRPV4 protein in Fuzi group and Huanglian group were significantly increased compared with blank control group(P<0.05), while the expression of TRPC6 protein in Fuzi and Huanglian group were decreased(P<0.05).ConclusionThe traditional Chinese medicine Fuzi and Huanglian all have the influence on the expression of TRPV4 and TRPC6 in kidney disease.

different drug properties; TRPV4； TRPC6

R363

A

1007-6611(2017)10-0999-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.10.005

国家自然科学基金资助项目(81072974)

王竹，女，1979-01生，博士，主治医师，E-mail：75467619@qq.com

2017-07-16