抗柯萨奇B病毒性心肌炎胶囊提取物总皂苷抑制心肌细胞凋亡的实验研究※

郑苗苗 王 芳 黄 玉 宋雨婷 姚荣妹

(华北理工大学中医学院2013级中西医临床专业本科生，河北 唐山 063210)

实验研究

抗柯萨奇B病毒性心肌炎胶囊提取物总皂苷抑制心肌细胞凋亡的实验研究※

郑苗苗 王 芳 黄 玉 宋雨婷 姚荣妹△

(华北理工大学中医学院2013级中西医临床专业本科生，河北 唐山 063210)

目的观察抗柯萨奇B病毒性心肌炎胶囊提取物总皂苷抑制急性心肌损伤小鼠心肌细胞凋亡的作用及机制。方法选用BALB/c小鼠60只，雌雄各半，随机分为6组，即正常对照组，模型组，复方丹参滴丸组，抗柯高、中、低剂量组，每组10只，正常对照组、模型组给予蒸馏水灌胃，给药组灌胃给药，均每日1次，连续7 d。从实验的第6 d开始，除正常对照组外，其它组小鼠腹腔注射盐酸异丙肾上腺素3 mg/(kg·d)，连续2 d，建立急性心肌损伤模型，检测各组小鼠心肌损伤标志物肌钙蛋白T(cTnT)、肌钙蛋白I(cTnI)含量以及细胞凋亡基因Bcl-2和Bax的蛋白表达。结果模型组小鼠cTnI和cTnT均降低，与正常对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)；各给药组cTnI和cTnT均高于模型组，复方丹参滴丸组、抗柯高、中剂量组与模型组比较差异尤为显著(P<0.01)。抗柯高、中、低剂量组心肌细胞凋亡率明显低于模型组，复方丹参滴丸组和抗柯高、中剂量组Bcl-2的表达与模型组比较显著升高(P<0.01)；各给药组Bax的表达与模型组比较明显降低(P<0.01)。结论抗柯萨奇B病毒性心肌炎胶囊提取物总皂苷有抑制急性心肌损伤小鼠心肌细胞凋亡的作用，通过上调心肌组织中Bcl-2的表达、下调Bax的表达，减轻心肌损伤标志物的释放来抑制心肌细胞的凋亡。

小鼠；皂甙；药理学；细胞凋亡；药物作用

急性心肌损伤是由各种原发疾病引起的心肌细胞的坏死凋亡。细胞凋亡则是由基因编码的细胞程序性死亡。异丙肾上腺素诱导急性心肌损伤可能与氧化应激、钙超载、炎症及脂质过氧化等有关[1]，从而发生细胞凋亡、坏死，最终导致心肌损伤。临床上治疗心肌损伤主要是运用清除氧自由基，改善微循环等药物改善和保护心肌细胞。我们在临床应用中发现抗柯萨奇B病毒性心肌炎胶囊(药物组成：西洋参、黄芪、牡丹皮、麦冬、五味子、莱菔子、王不留行)不仅对病毒性心肌炎患者有很好的治疗效果，而且对心肌缺血造成的冠心病患者亦有不错的治疗效果。抗柯萨奇B病毒性心肌炎胶囊具有益气安神、补血养心的作用[2-3]，考虑其抗心肌缺血的作用与改善微循环和保护心肌细胞有关，因此本实验提取该复方有效成分群(总皂苷)，观察其是否具有抑制急性心肌损伤小鼠心肌细胞凋亡的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 6～7周龄Balb/c小鼠60只，雌雄各半，清洁级，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK(京)2009-0004。

1.1.2 药物及制备 抗柯萨奇B病毒性心肌炎胶囊由西洋参、黄芪、牡丹皮、麦冬、五味子、王不留行、莱菔子组成。中药饮片均购于华北理工大学附属医院门诊，经鉴定，各味饮片实物与名称相符，质量符合《中华人民共和国药典》标准。

抗柯萨奇B病毒性心肌炎胶囊总皂苷制备方法：称取10剂复方药材(过20目筛)共1 200 g，精密称定，置圆底烧瓶中，分别加入6、8倍量80%乙醇，加热回流提取3次，每次2 h，合并提取液(即含药的乙醇)，趁热过滤，滤液用旋转蒸发器浓缩药液，同时回收乙醇，浓缩液先用石油醚萃取，用梨形漏斗，用力混匀，静置3 h分层，取上清液，3次；再用水饱和正丁醇萃取3次，取下层药液，合并提取液，用旋转蒸发器回收正丁醇，剩余药液用浓缩锅干燥，在65 ℃鼓风干燥箱中干燥至恒质量，即得总皂苷58.4 g(每g药粉含生药20.5 g)。提取物已请华北理工大学基础医学院药学系吕立勋副教授做含量检测，总皂苷含量为80%，符合本课题试验要求。

复方丹参滴丸(天士力制药集团有限公司，国药准字Z10950111，批号：131018，规格：27 mg/丸)。

盐酸异丙肾上腺素注射液(上海禾丰制药有限公司，国药准字H31021344，批号：131103，规格：2 mL∶1 mg)。

1.1.3 主要试剂 无水乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，规格：500 mL/瓶)；石油醚(天津市富宇精细化工有限公司，规格：500 mL/瓶)；正丁醇(天津市博迪化工股份有限公司，规格：500 mL/瓶)；心肌肌钙蛋白T(cTnT)、肌钙蛋白I(cTnI)测定试剂盒均购自上海百沃科贸有限公司，生产批号分别为BV-E12121503、BV-E12121501；免疫组化(SP)试剂盒、兔抗大鼠Bax(IgG)、兔抗大鼠Bcl-2(IgG)、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、多聚赖氨酸均购自北京博奥森生物技术有限公司。

1.1.4 主要仪器 电子调温电热套(天津泰斯特仪器有限公司，98-1-B)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器有限公司，RE-5205)；低温离心机(上海安亭科学仪器厂，TDL-5-A)；电热鼓风干燥箱(上海博讯实业有限公司，GZX-9070 MBE)；梨形分液漏斗(上海达丰玻璃仪器厂，规格：2 000 mL，1 000 mL，500 mL)；心电图机(上海医用电子仪器厂，ECG-6511)；数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司，HH-6)；Bio-Rad3550型自动酶联免疫测定仪(美国Bio-Rad公司)；石蜡切片机、染色机、脱水机(德国Leica公司)；BX53光学显微镜和Image-Pro Plus图像分析系统(日本Olympus公司)；MP200A型电子天平(上海第二天平仪器厂)等。

1.2 方法

1.2.1 分组给药 Balb/c小鼠适应性喂养7 d，生理记录仪检测小鼠Ⅱ导联心电图，ST段接近等电位线，T波无低平者入选[2]。选出60只，雌雄各半，按体质量随机分为6组，每组10只，分别为正常对照组、模型组、复方丹参滴丸组[给药量80 mg/(kg·d)]，按成人体质量60 kg临床应用剂量810 mg/d计算)，抗柯高剂量组(给药量为40 g生药/kg·d)、中剂量组(给药量为20 g生药/kg·d)、低剂量组(给药量为10 g生药/kg·d)，正常对照组和模型组给予蒸馏水，给药方式均为灌胃给药，各组均每日1次，连续7 d。

1.2.2 造模 从实验的第6 d开始，除正常对照组外，其它各组小鼠腹腔注射盐酸异丙肾上腺素3 mg/(kg·d)，连续2 d，建立急性心肌损伤模型。正常对照组腹腔注射等容积的0.9%氯化钠注射液[4]。

1.2.3 取材 无菌操作下摘取小鼠眼球取血，4 ℃静置后离心(800 r/min，10 min)，分离血清，放入-20 ℃冰箱储存。随后迅速将小鼠颈椎脱臼处死，剖开胸腔，剪取心脏，用10%多聚福尔马林常温下固定，石蜡包埋，常温固定，常规切片(厚5 μm)。

1.2.4 检测指标

1.2.4.1 肌钙蛋白cTnI和cTnT的含量测定 cTnI(胶乳增强免疫比浊法)、cTnT(胶乳增强免疫比浊法)严格按试剂盒说明书操作。

1.2.4.2 免疫组织化学检测细胞凋亡基因Bax和Bcl-2蛋白表达 切除心尖用10%福尔马林常温下固定，石蜡包埋，常温固定，常规切片(厚5 μm)。采用SP二步法进行免疫组织化学染色，具体步骤按试剂盒说明书操作。阴性对照用磷酸缓冲液(PBS)替代一抗。细胞浆、细胞膜、间质中出现棕黄色颗粒，且其着色强度高于背景非特异性染色者判定为阳性。在每张切片阳性表达区随机选择5个高倍视野(×400)，用Image-Pro Plus 5.1图像分析系统对所选视野内的阳性信号进行图像分析，测定各组阳性信号的积分吸光度(IA)，进行半定量分析。

2 结 果

2.1 各组心肌损伤标志物cTnT、cTnI含量比较 见表1。

组 别n给药剂量cTnⅠcTnT正常对照组10-0．89±0．153．89±0．38模型组10-0．57±0．11∗0．95±0．26∗复方丹参滴丸组100．08g/(kg·d)0．76±0．26∗△2．33±0．39∗△抗柯高剂量组1010g/(kg·d)0．71±0．18∗△2．22±0．23∗△抗柯中剂量组105g/(kg·d)0．74±0．19∗△2．40±0．49∗△抗柯低剂量组102．5g/(kg·d)0．69±0．25∗△#1．66±0．42∗△#

与正常对照组比较，*P<0.01；与模型组比较，△P<0.01；与复方丹参滴丸组比较，#P<0.01

由表1可见，模型组及各给药组小鼠心肌组织cTnI和cTnT均降低，与正常对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)；各给药组cTnI和cTnT均高于模型组，复方丹参滴丸组、抗柯高、中、低剂量组与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01)；复方丹参滴丸组与抗柯低剂量组比较差异有统计学意义(P<0.01)，与抗柯高、中剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组对细胞凋亡基因Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 见表2，图1、2。

组 别n给药剂量Bcl-2(IA)Bax(IA)正常对照组10-18．77±2．5410．67±2．31模型组10-27．76±3．75∗44．17±5．39∗∗复方丹参滴丸组100．08g/(kg·d)42．15±5．36∗∗△△29．65±4．28∗∗△△抗柯高剂量组1010g/(kg·d)42．77±4．13∗∗△△28．77±4．69∗∗△△抗柯中剂量组105g/(kg·d)46．77±6．93∗∗△△28．02±6．39∗∗△△抗柯低剂量组102．5g/(kg·d)34．27±6．89∗∗#33．27±6．84∗∗△△

与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与复方丹参滴丸比较，#P<0.05

正常对照组(×400) 模型组(×400) 复方丹参滴丸组(×400)

抗柯高剂量组(×400) 抗柯中剂量组(×400) 抗柯低剂量组(×400)

图1 各组大鼠心肌细胞凋亡基因子Bax蛋白表达

正常对照组(×400) 模型组(×400) 复方丹参滴丸组(×400)

抗柯高剂量组(×400) 抗柯中剂量组(×400) 抗柯低剂量组(×400)

图2 各组大鼠心肌细胞凋亡基因子Bcl-2蛋白表达

由图1、2可见，各组大鼠细胞浆、细胞膜、间质中均可见棕黄色颗粒，均有Bcl-2和Bax蛋白表达。模型组可见大量成片的黄色颗粒沉积物，抗柯高、中剂量组及复方丹参滴丸组颗粒沉积相对较少，正常对照组只有少量表达。由表2可见，与正常组比较，模型组Bcl-2和Bax蛋白表达均明显增高。与模型组比较，复方丹参滴丸组和抗柯高、中剂量组Bcl-2的表达显著升高(P<0.01)，抗柯低剂量组Bcl-2的表达升高不明显(P>0.05)；各给药组Bax蛋白表达与模型组比较明显降低(P<0.01)。抗柯高、中、低剂量组与复方丹参滴丸组Bax蛋白表达比较差异均无统计学意义(P>0.05)；抗柯高、中剂量组与复方丹参滴丸组Bcl-2蛋白表达比较差异均无统计学意义(P>0.05)。抗柯低剂量组与复方丹参滴丸组比较，Bcl-2表达水平略低(P<0.05)。

3 讨 论

中医学虽无心肌损伤这个病名，可属中医学心悸、怔忡、胸痹等范畴，治疗首选方法为益气通络、活血化瘀。抗柯萨奇B病毒性心肌炎胶囊以益气安神、补血养心为主。方中西洋参、麦冬、五味子取中药方剂生脉饮之义，益气养阴，补益心气；黄芪甘温补气益阳；牡丹皮、王不留行味苦以开泻，两药同用，以活血祛瘀通脉；莱菔子行气降气与西洋参相反相成共收强心除满之效[2-3]。

心肌损伤和心肌细胞凋亡(是调控细胞稳态的机制之一)最终都可以导致心肌坏死，是不同阶段心肌损伤的表达，心肌损伤是分子生物学过程，而心肌凋亡是基因程序性死亡的结果。本研究心肌损伤的检测选用了心肌肌钙蛋白(cTn)和细胞凋亡因子两方面指标。肌钙蛋白是由T、C、I 3个亚基构成，和原肌球蛋白一起通过调节钙离子对横纹肌动蛋白ATP酶的活性来调节肌动蛋白和肌球蛋白相互作用。肌钙蛋白T和肌钙蛋白I是心肌损伤的血清标志物，对心肌损伤极其具有敏感性和特异性[5]，是目前最理想的诊断心肌损伤的标志物[6]。Bcl-2基因蛋白家族在细胞调亡通路中起着重要的调节作用[7]。Bcl-2家族可以分为两大类，一类是抗凋亡的基因，主要有Bcl-2、Bcl-X1、Bcl-W、Mcl-1、CED9等，另一类是促细胞凋亡的基因，主要有Bax、Bak、Bcl-XS、Bad、Bik、Bid等。Bcl-2可与Bcl-X1、Bcl-W、Bax、Bad和Mcl-1形成同源的蛋白二聚体，而特定的蛋白二聚体可作为在细胞死亡信号通路上的分子调控点。Bcl-2可与促凋亡基因Bax形成二聚体，如果Bcl-2相对量高于Bax，则促进形成Bcl-2/Bax异二聚体，并使Bcl-2同二聚体的数量增多，抑制线粒体通透性改变，从而抑制细胞凋亡；如果Bax相对量高于Bcl-2，则形成Bax-Bax同源二聚体，Bax同二聚体数量增多，便会转位到线粒体膜，改变线粒体膜的通透性，促使细胞色素C释放、凋亡小体的形成、启动Caspase酶系级联反应，从而导致细胞凋亡[8-11]。由此可见，Bcl-2基因家族成员通过相互竞争形成同源或异源二聚体，可以调控线粒体的通透性，间接调节蛋白酶和核酸酶活性，从而双相调节细胞凋亡[12-14]，Bcl-2和Bax蛋白的相对含量是决定细胞凋亡的分子调控点[15]。

本实验中，正常对照组与模型组cTnI和cTnT的活性比较差异均有统计学意义(P<0.01)，说明急性心肌损伤动物模型建模成功。抗柯高、中、低剂量组cTnI和cTnT含量均高于模型组(P<0.01)，说明该提取物对急性心肌细胞损伤有改善作用。免疫组化实验结果显示，抗柯高、中剂量组Bcl-2蛋白表达显著升高，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.01)；抗柯高、中、低剂量组Bax蛋白表达与模型组比较均明显降低(P<0.01)。Bcl-2表达增加可以拮抗Bax功能抑制细胞凋亡[15]，这说明该提取物能减少由于急性心肌缺血导致的心肌细胞损伤，保护细胞形态完整性，缩小心肌梗死范围。

从整个实验结果来看，抗柯萨奇B病毒性心肌炎胶囊总皂苷有抑制急性心肌损伤小鼠心肌细胞凋亡的作用，可能通过上调心肌组织中Bcl-2的表达、下调Bax的表达，减轻心肌损伤标志物的释放来抑制心肌细胞的凋亡。

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ExperimentalstudyontotalsaponinsextractedfromcoxsackieBviralmyocarditiscapsuleinhibitthemyocardialapoptosis

ZHENGMiaomiao*,WANGFang,HUANGYu,etal.

*2013-GradeUndergraduateStudentofChineseandWesternmedicineClinicalSpecialty,CollegeofTraditionalChineseMedicineofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Hebei,Tangshan063210

ObjectiveTo observe the effects and mechanism of the total saponins extracted from coxsackie B viral myocarditis capsule inhibit the myocardial apoptosis in mice with acute myocardial injury.Methods60 Balb/c mice with male and female half were randomly divided into 6 groups that is normal control group, model group,compound Danshen dripping pills group, high-dose total saponins group, medium-dose total saponins group and low-dose total saponins group, 10 mice in each group.The normal control group and model group were treated by distilled water,the drug groups were trented by medicine once aday,continuously for 7 d. From the 6th d of the experiment, except for the normal control group, the other five groups were injected intraperitoneally with isoprenaline hydrochloride by 3 mg/(kg·d) for 2 d to establish the model of acute myocardial injury. The contents of myocardial injury markers including troponin T (cTnT) and troponin I (cTnI), and the protein expression of cell apoptosis genes Bcl-2 and Bax were detected in each group.ResultsThe cTnI and cTnT reduced in model group, and there were statistical differences on cTnI and cTnT between the model group and normal control group (P<0.01). The cTnI and cTnT in each drug group were higher than that in model group, and the differences among compound Danshen dripping pills group,high-dose total saponins group, medium-dose total saponins group and model group were particularly significant (P<0.01). The apoptotic rate of myocardial cells in total saponins groups was significantly lower than that in model group, and the expressions of Bcl-2 in compound Danshen dripping pills group, high-dose total saponins group, medium-dose total saponins group were significantly higher than that in model group (P<0.01). The expression of Bax in each drug groups was significantly lower than that in model group (P<0.01).ConclusionTotal saponins extracted from coxsackie B viral myocarditis capsule has the effect of inhibiting the apoptosis of myocardial cells in mice with acute myocardial injury by up-regulating the expression of Bcl-2 and down-regulating the expression of Bax and decreasing the release of myocardial injury markers.

Mouse; Saponins; Pharmacology; Apoptosis; Drug effect

R-332;R284.1;R329.25

A

1002-2619(2017)09-1359-06

2017-06-26)

(本文编辑：董军杰)

10.3969/j.issn.1002-2619.2017.09.021

※ 项目来源：河北省中医药管理局2016年度中医药类科研计划课题(编号：2016072)；华北理工大学2016年度大学生创新创业训练计划项目(编号：X2016068)

△ 通讯作者：华北理工大学中医学院实验中心，河北 唐山 063210

郑苗苗(1994—)，女，本科在读。研究方向：心肌病的中医药研究。