三七皂苷S-6的溶血性及体外免疫活性研究

秦 枫，朱善元，成大荣，陈玉勇，左伟勇，王安平，王永娟，吴 双，洪伟鸣

（1. 江苏农牧科技职业学院 江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，泰州 225300；2. 扬州大学兽医学院，扬州 225009）

三七皂苷S-6的溶血性及体外免疫活性研究

秦 枫1,2，朱善元1，成大荣1,2，陈玉勇1，左伟勇1，王安平1，王永娟1，吴 双1，洪伟鸣1

（1. 江苏农牧科技职业学院 江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，泰州 225300；2. 扬州大学兽医学院，扬州 225009）

研究三七皂苷S-6 的溶血性及体外免疫活性。常规方法提取PNS，大孔树脂柱层析分离纯化得S-6。溶血试验测定红细胞溶血率。脾淋巴细胞毒性试验确定S-6 的安全剂量范围，体外脾淋巴细胞增殖反应和IL-2的诱生及含量测定检测S-6 的体外免疫活性。S-6 溶血性较小，2 mg/mL浓度以下无溶血性；S-6（0.1 μg/mL、1 μg/mL）显著促进了Con A诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应，且与PNS和APS组相比，差异不显著；S-6（1 μg/mL）极显著地促进了LPS诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖反应，且与PNS相比，S-6（1 μg/mL）差异显著，其余各个剂量与PNS和APS组相比，差异不显著；S-6（12.5 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL）显著或极显著地提高了IL-2的含量，且与PNS和APS组相比，差异不显著。S-6 安全性好，体外具有较好的细胞免疫活性和诱生细胞因子的能力。

S-6；溶血性；体外免疫活性；脾淋巴细胞增殖反应；IL-2

Abstract:To investigate the hemolytic characteristics and biologic immunocompetence of S-6 in vitro, PNS was extracted using butyl alcohol and S-6 was obtained by separation and puri fi cation with D101 macroreticular resin. The in vitro hemolytic activity, range of safe dose and immunocompetence of S-6 were examined for parameters including hemolysis, inducible and content determination of IL-2, splenocyte toxicity and proliferation. The hemolytic activity of S-6 was lower than 2 mg/mL. S-6 significantly increased concanavalin A-stimulated splenocyte proliferation in vitro at 0.1 μg/mL. However, S-6 had no signi fi cant difference with PNS and APS at 1 μg/mL. S-6 signi fi cantly increased concanavalin lipopolysaccharide-stimulated splenocyte proliferation in vitro at 1 μg/mL and had signi fi cant difference with PNS. S-6 also increased the content of IL-2 at 12.5 μg/mL, 25 μg/mL and 50 μg/mL and had no signi fi cant difference with PNS and APS. In conclusion, S-6 had high security and increased cellular response and in vitro content of IL-2.

Key words:S-6; hemolytic characteristics; immunocompetence in vitro; splenocyte proliferation; IL-2

近年来，新城疫、禽流感、口蹄疫、猪蓝耳等畜禽疾病在各地频繁爆发，给我国畜牧养殖业带来重大损失。疫苗免疫是目前控制动物传染病的较好的方法。然而，虽然大部分养殖企业严格按照免疫流程接种疫苗，但很多情况下免疫效果并不理想，很多传染病仍不能从根本上得以控制。如在疫苗免疫的同时，配合应用免疫增强剂可以提高疫苗的免疫应答能力，因此研制出高效、安全的免疫增强剂成为畜牧业发展的迫切需求。三七为五加科人参属植物三七Panax notoginseng（Burk.）F. H. Chen的根及根茎，是历年来医家圣药，其主要有效成份为三七总皂苷（PNS），含有多种单体皂苷，具有抑制血小板凝集、降低心肌耗氧量等作用，近来，随着其抗肿瘤作用的发现，其研究日益广泛[1]。皂苷在高等动物消化道中吸收要经过转化，故口服一般无溶血性，但其注射剂应用于临床对溶血性要求很高，故研究其溶血性对临床用药安全性评价有重要的作用。Sun等[2,3]已经报道过PNS对于OVA受免小鼠的免疫作用，但其不同极性组分的免疫作用研究较少。S-6系PNS中皂苷含量最高的组分，本文旨在探讨S-6的溶血性和体外免疫活性，为PNS分离精制工艺的优化及临床合理用药等提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物新西兰兔，普通级，体重（2.6±0.2）kg；ICR小鼠，体重（18～22）g。均购自扬州大学兽医学院动物比较医学中心。

1.2 试剂三七药材，购于文山三七研究院；黄芪多糖（APS），江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室制备，含量为78%；刀豆蛋白A（Con A），脂多糖（LPS），噻唑蓝（MTT），均为美国Sigma公司产品；小鼠IL-2测定试剂盒购自扬州科能生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.3 仪器NU-4750E型CO2培养箱，购自上海三发科技仪器公司；EL×800型酶联免疫检测仪、CKX41型倒置显微镜，均购自美国伯腾仪器科技有限公司；RE-3000型旋转蒸发仪，购自上海亚荣生化仪器厂；HPX-9162MBE 型电热恒温培养箱，购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂；KQ-2200DB 型数控超声波清洗器，购自昆山市超声仪器有限公司。

1.4 S-6 的制备按文献[3]所报道方法，制备精制三七总皂苷PNS。将PNS经D101大孔吸附树脂柱初步分离，得到S-1、S-2、S-3、S-4 4个组份。S-2以大孔树脂柱再次分离，得S-5、S-6 2个组份，各部分单独收集浓缩，各组份的含量测定，按文献[4]方法进行，S-6系含量最高的组份，总皂苷含量为815. 2 mg/g。

1.5 S-6 溶血性的测定

1.5.1 红血球细胞悬浮液的制备 按文献[2]的方法，调整红细胞悬液浓度为2%。

1.5.2 测定 按文献[2]方法进行，PNS、S-6分别以生理盐水稀释，配制成浓度为4 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL、0.25 mg/mL的浓度系列，并设4个重复；以蒸馏水和生理盐水组分别作阳性对照组和阴性对照组溶血对照。测定OD412值。

1.5.3 溶血率的计算 溶血率=(Ti-T0)/(Tmax-T0)×100。Tmax：阳性对照作用组的吸光度；T0：阴性作用组吸光度；Ti：不同浓度的PNS、S-6作用时测得的吸光度。阳性对照组和阴性对照组的溶血率分别为100%和0%。

1.6 脾淋巴细胞毒性试验

1.6.1 脾细胞悬液制备 无菌条件下取小鼠的脾脏，加适量Hanks液研磨，以200目不锈钢网滤过，1500 rpm离心5分钟，弃上清，加Hanks液重复洗涤2次。收集脾细胞，加适量RPMI 1640培养液混悬，以0.4%台盼兰活细胞拒染法计数，活细胞数不小于95%，加RPMI 1640完全培养液稀释，并调整细胞浓度至1×107个/mL。

1.6.2 脾淋巴细胞毒性的测定 于96孔培养板中每孔加入脾细胞悬液100 μL，各加入50 μL的PNS、S-6和APS进行处理，并设培养液为对照组。每个处理设3个重复孔。置37℃、5%CO2培养箱温育48 h，培养终止前4 h加5 mg/mL MTT（20 μL/孔），终止培养后，离心，弃上清，每孔加DMSO 150 μL，振荡10 min，测定OD570。

1.7 S-6 免疫活性测定

1.7.1 脾淋巴细胞增殖反应 按文献[3]的方法进行，并计算其刺激指数（SI）。

1.7.2 小鼠脾细胞上清中IL-2含量的测定

1.7.2.1 小鼠 IL-2 的诱生 按文献[5]的方法在无菌条件下常规方法制备小鼠脾细胞，台盼蓝染色计数活细胞数（应在95% 以上），用含10%小牛血清的RPM I-1640 调整细胞浓度为 5×106个/mL，加入24孔培养板中，每孔1 mL，每孔加入Con A 50 μL（终浓度 5 μg/mL）和500 μL不同浓度（50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL）的PNS、S-6 和APS，每个浓度设3孔，对照组加入完全培养液。在 37℃、5% CO2条件下培养 48 h，离心（268×g，10 min），收集上清，－20℃保存。

1.7.2.2 小鼠IL-2的检测 按照试剂盒说明，用双抗体夹心ELISA法检测IL-2的含量。

1.8 统计学分析所得数据用±s表示，并用SPSS 17.0独立样本t检验法比较各组间的统计学差异。

2 结果

2.1 溶血性试验结果由表1可以看出，在0.5 mg/mL时，PNS开始出现明显的溶血作用，与阴性对照溶血性具有显著统计学意义（P＜0.05）；在2 mg/mL浓度以下，S-6几乎无溶血作用，而PNS的溶血作用与阴性对照的溶血性具有极显著统计学意义（P＜0.01），此浓度远小于临床应用浓度；4 mg/mL时，呈现极明显的溶血作用。

表1 S-6的溶血性试验结果Table 1 The results of the hemolytic experiment (the percentage of hemolysis

2.2 S-6对脾脏细胞安全浓度的测定S-6对脾脏细胞安全浓度的测定详见表2，在所选浓度范围内，PNS、S-6及APS均在500 μg/mL 时，其细胞OD570值与对照组差异不具备统计学意义（P＞0.05）。因此，为便于在相同浓度比较其活性，选择100 μg/mL浓度开始测定S-6的活性。

表2 S-6对小鼠脾淋巴细胞安全浓度Table 2 The safe concentration of S-6 to splenic lymphocyte of mice

2.3 免疫活性试验结果

2.3.1 S-6体外对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响S-6体外对Con A和LPS诱导小鼠T、B淋巴细胞增殖反应影响，结果见图1、图2。由图1可见，PNS（1～100 μg/mL）、APS（0.1～100 μg/mL）和S-6（0.1 μg/mL）体外均能显著或极显著促进Con A诱导的小鼠T淋巴细胞增殖反应（P＜0.05或P＜0.001）。且S-6的作用与PNS、APS差异具有极显著统计学意义（P＜0.01）。由图2可见，PNS（1～100 μg/mL）、APS（0.1～100 μg/mL）和S-6（0.1 μg/mL）体外均能显著或极显著促进LPS诱导的小鼠B淋巴细胞增殖反应（P＜0.05或P＜0.001），1～10 μg/mL时，S-6和APS之间差异具有极显著统计学意义（P＜0.001）。

图1 S-6体外对Con A诱导小鼠T淋巴细胞增殖能力的影响Fig. 1 Effect of S-6 on Con A-stimulated T lymphocytes proliferation of mice in vitro

图2 S-6体外对LPS诱导小鼠B淋巴细胞增殖能力的影响Fig. 2 Effect of S-6 on LPS-stimulated B lymphocytes proliferation of mice in vitro

2.3.2 S-6体外对小鼠脾细胞产生IL-2能力的影响 如表3所示，PNS、S-6、APS浓度在试验范围内对小鼠 T细胞分泌 IL-2 均表现出一定的增强作用，且浓度在12.5～50 μg/mL时对 IL-2 分泌的促进作用具有极显著统计学意义（P＜0.01）。S-6与相同浓度的PNS、APS相比，差异不具备统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 S-6的溶血性研究皂苷具有溶血性，据研究[6]，其溶血性与分子结构有很大的关系，并不是所有的皂苷都有溶血性，且三萜皂苷的溶血性小于甾体皂苷。Quil A系从南美皂树Quillaja saponaria中分离得到的三萜总皂苷，具有较好的免疫活性，广泛应用于动物临床，但溶血性很大，其半数溶血量（hemolytic dose，HD50）为19.91±0.57 μg/mL[7]。本文溶血性试验结果证实了S-6的溶血性显著低于Quil A，安全性较好。

相关学者对三七的溶血性做了一定的研究。张剑锋等[8,9]以三七为主要成分的血塞通注射液为研究对象，就肉眼观察法、红细胞计数法和分光光度法3种溶血检测方法进行了对比研究，发现分光光度法较其他2种方法更适合用于药物溶血活性的检测，并检测了不同血塞通注射液作用于兔红细胞后的溶血作用和血红蛋白变化，结果表明，在达到一定浓度时，可出现正常溶血和异常溶血情况，正常溶血下，血红蛋白释放出来，异常溶血下，血红蛋白的特征吸收峰发生了变化，提示发生了结构转化。静脉注射由于皂苷直接作用于红细胞未经过转化，易发生溶血，其溶血作用与体外作用相似,口服制剂由于经过胃肠道吸收、转化，仅少数有溶血性。唐娇[10]以大鼠为试验动物，取三七粉按照高、中、低三个剂量组按照各自的剂量灌胃，连续灌胃90 d，取抗凝血进行血液学指标检测，结果发现红细胞计数、血红蛋白含量等指标与对照组相比均未见统计学差异。取血清进行血清溶血素试验，测定血清溶血素的半数溶血值，与对照组相比没有统计学差异。由于S-6的溶血性远小于三七的主要成分PNS，在临床上，合理控制S-6的浓度，可以安全应用。

表3 S-6对小鼠脾淋巴细胞分泌IL-2的影响Table 3 Effect of S-6 on the secretion of IL-2 from spleen lymphocytes of mice

3.2 S-6体外对小鼠脾淋巴细胞增殖能力的影响淋巴细胞增殖是反映细胞免疫最直接的指标，有丝分裂原Con A能够诱导T淋巴细胞的分裂，T淋巴细胞是介导细胞免疫的一种重要反应，可以抵抗细胞内微生物感染，其数量和功能直接对细胞免疫具有决定性的作用。有丝分裂原LPS能够促进B淋巴细胞的增殖，并能够产生各种抗体，主要参与体液免疫反应，本研究证明了S-6既能促进T淋巴细胞的增殖，也能促进B淋巴细胞的增殖反应，但效果较PNS差。

3.3 S-6体外对小鼠脾细胞产生IL-2能力的影响IL-2主要由活化的CD4+Th1细胞产生，可促进Th0和CTL的增殖，具有广泛的生物活性。各种刺激物活化的T细胞一般不能在体外培养中长期存活，加入IL-2则能其长期持续增殖，因此IL-2又称为T细胞生长因子。静止的T细胞表面不表达IL-2R，对IL-2没有反应；受丝裂原或其他刺激活化后T细胞才能表达IL-2R，成为IL-2的靶细胞；而IL-2又可诱导靶细胞增加IL-2R的表达。IL-2对B细胞的生长及分化均有一定的促进作用，较高密度的IL-2可诱导B细胞生长繁殖，促进抗体分泌，并诱使B细胞由分泌IgM向着分泌IgG2转换。IL-2能在体外与IL-4、IL-5和IL-6一起共同诱导细胞毒性T细胞（Tc）的产生，增强T细胞的杀伤能力。

本研究发现，各种浓度的S-6均可以促进小鼠T 细胞 IL-2 的分泌，在较低剂量下即可促进小鼠 T细胞 IL-2的分泌。但随着S-6 浓度的升高，促进作用有所下降。S-6对Con A诱导的小鼠 T 体外淋巴细胞转化实验也呈现这种趋势。其原因可能与IL-2 和淋巴细胞之间的协同作用有关，即S-6首先促进了IL-2 的分泌，IL-2 作为一种激活物诱导T淋巴细胞表达IL-2R，进而诱导IL-2的产生。

综上，S-6的溶血性较小，安全浓度较高，能够显著促进体外T、B淋巴细胞增殖，且能够促进IL-2的表达，其体外免疫增强效果较APS强，但与PNS相比，差异不显著，不具备统计学意义，这表明若如要进一步对PNS进行分离纯化，得到含量较高的皂苷，并不影响其免疫活性，PNS里含有的其他类别物质如多糖类亦可能对免疫功能有一定的促进作用，其体内作用及作用机制尚需进一步研究。

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STUDY ON HEMOLYTIC ACTIVITY AND IMMUNOCOMPETENCE OF S-6 IN VITRO

QIN Feng1,2, ZHU Shan-yuan1, CHENG Da-rong1,2, CHEN Yu-yong1, ZUO Wei-yong1, Wang An-ping1,Wang Yong-juan1, WU Shuang1, HONG Wei-ming1

(1. Jiangsu Provincial Key Laboratory of Veterinary Bio-pharmaceutical High-tech Research Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, Taizhou 225300, China; 2. College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)

S853.74

A

1674-6422（2017）04-0045-05

2016-12-28

江苏省兽用生物制药高技术研究中心重点实验室开放基金资助项目；江苏省产学研合作项目“新型中兽药免疫增强剂复方桑杜口服液的研制”项目(BY2015066-01)；江苏高校“青蓝工程”资助；“泰州市311人才工程”项目；学院“凤凰人才工程”项目

秦枫，女，博士，副教授，主要从事天然药物与动物免疫药理研究

朱善元，E-mail：jstzzsy@126.com