新型三嗪类抗球虫药沙咪珠利在鸡体外各组织中的代谢比较

赵 晓，张丽芳，郭春娜，王春梅，王霄旸，张可煜，费陈忠，王 米，薛飞群，刘迎春

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

新型三嗪类抗球虫药沙咪珠利在鸡体外各组织中的代谢比较

赵 晓，张丽芳，郭春娜，王春梅，王霄旸，张可煜，费陈忠，王 米，薛飞群，刘迎春

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

沙咪珠利（Ethanamizuril，EZL）是中国农业科学院上海兽医研究所自主研发的一种新型三嗪类抗球虫药。沙咪珠利给鸡灌服后在其体内被代谢为多种代谢产物，其中代谢物M3为主要代谢产物之一。在研究沙咪珠利在鸡各组织中残留消除规律的过程中发现，一定量的沙咪珠利添加到相同重量的肾脏、肝脏以及肌肉组织匀浆中，样品前处理后，通过UPLC方法检测，在肾脏组织几乎未检测到原药沙咪珠利，却意外检测到了代谢物M3，而在其他组织中未见此种现象发生。为了进一步研究此种情况，我们称取等量的肾脏匀浆组织，添加沙咪珠利后于不同时间处理，结果发现孵育20 min后肾脏中几乎检测不到原药；另外，将鸡体肾脏组织高温处理后，再添加沙咪珠利处理，则可以检测到沙咪珠利，研究结果表明原药沙咪珠利主要在肾脏组织中被代谢为M3。该研究结果为进一步研究沙咪珠利在鸡体的代谢途径提供了重要研究基础。

新型抗球虫药；组织代谢；沙咪珠利；UPLC

Abstract:Ethanamizuril (EZL), a novel anti-coccidiosis triazine compound, was synthesized in the Shanghai Veterinary Research Institute of the Chinese Academy of Agricultural Sciences. After being administered to chickens, it was metabolized to many metabolites,among which M3 was one of the main metabolites. During the experiment, EZL was spiked to kidney tissue homogenates of chickens at room temperature, one of its metabolite M3 was detected unexpectedly. However, when EZL was spiked to the same amount of liver and muscle tissue homogenates, there was no M3 detected. In order to further study this phenomenon, EZL was spiked into kidney homogenates and processed the samples at different incubation times. The results showed that EZL was almost undetectable in kidney tissue after 20 min incubation. In addition, EZL was added into chicken kidney tissues for incubation at 60℃ for 2 h and EZL wasdetected by UPLC after pretreatment. The results showed that M3 was mainly formed in the chicken kidneys, which provided an important basis for further study on the metabolic pathways of EZL in chickens.

Key words:Novel triazine coccidiostats; tissue metabolism; ethanamizuril; UPLC

随着家禽养殖业的蓬勃发展和我国养殖密度的增加，鸡球虫病已经成为一种常见且严重影响养殖业健康发展的疾病，给畜牧业造成了很大的损失[1,2]。鸡球虫病作为一种寄生性原虫病，使用疫苗很难对球虫病进行全面保护，宿主仍然有感染球虫的风险[3]。所以抗球虫药物仍然是防治畜禽球虫病的可靠手段[4]。20世纪80年代出现的三嗪类抗球虫药因其高效、广谱、毒性低，在畜牧业生产中受到了广泛的重视和应用，目前生产中使用的三嗪类抗球虫药主要有2种：地克珠利（Diclazuril）和妥曲珠利（Toltrazuril）。三嗪类抗球虫药可通过抑制球虫呼吸链酶的活性，抑制球虫细胞线粒体内的氧化磷酸化作用，导致球虫的呼吸作用受阻，从而影响虫体的正常新陈代谢，导致球虫死亡[5-9]。然而，由于抗球虫药的滥用导致耐药性严重产生、生态环境毒性等一系列危害[10,11]。

沙咪珠利（Ethanamizuril，EZL）是本实验室在地克珠利和妥曲珠利的基础上自主研发的一种新型三嗪类抗球虫药。早期药效学研究证实其有使用剂量低、抗球虫活性高，具有成为新型抗球虫药物的潜力[12]。然而沙咪珠利上市前，为确保动物性食品的安全以及为制定合理的休药期提供可靠的理论依据，考察其在鸡体的体内、外代谢以及残留消除规律尤为必要。

前期研究发现，沙咪珠利在鸡体内可代谢为多种产物，M3为其主要代谢产物之一。样品前处理试验过程中发现，当沙咪珠利添加到相同重量的肾脏、肝脏以及肌肉组织匀浆中，通过UPLC方法检测，在肾脏组织几乎未检测到原药沙咪珠利，却意外检测到了代谢物M3，而在其他组织中未见这种现象发生。为了进一步研究这种情况，我们将鸡体肾脏组织高温处理后，再添加沙咪珠利处理，采用UPLC方法检测沙咪珠利和M3，从而为进一步研究沙咪珠利在鸡体的代谢途径提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂超高效液相色谱仪（ACQUITY UPLC系列，美国Waters公司）；紫外检测器（ACQUITY UPLC TUV 系列，美国 Waters 公司）；涡旋混合器（XW-OA，上海医科大学仪器厂）；超声仪（SCQ-250，上海声谱科学仪器厂）；离心机（An-ke LXJ-ⅡB，上海安亭科学仪器厂）；氮吹仪（美国Organomation Associates公司）；微量台式离心机（美国ThermoScientific）；Oasis MCX 3cc（60 mg）固相萃取小柱购（美国Waters公司；沙咪珠利及其代谢物M3标准品（由中国农业科学院上海兽医研究所制备），纯度分别不低于99.5%和 98.0%；色谱级乙腈、甲醇购自 Fisher公司；碳酸钠及其余试剂均为分析纯。

1.2 样品前处理准确称取鸡组织（肌肉、肝脏、肾脏）各匀浆2.0(±0.02) g，置于50 mL聚丙乙烯离心管中，加入10 mL乙腈，1 mL 10%的碳酸钠水溶液，充分涡旋，超声30 min，4000×g离心10 min，取5.5 mL上清液于10 mL离心管中，水浴60℃氮气吹干。用10%甲醇水（含0.1%的甲酸）2 mL复溶，甲酸调pH至5.2左右，加载至经甲醇活化、水平衡过的Oasis MCX固相萃取柱，加5 mL 含0.1%甲酸的30%的甲醇水淋洗后，用5 mL 5%氨化甲醇溶液洗脱，将洗脱液在60℃水浴下氮气吹干，用1 mL乙腈∶水（3∶7，V/V），0.8 mL正己烷复溶，充分涡旋，12 000×g离心10 min，用0.22 μm微孔滤膜过滤，进样检测，进样量5 μL。

1.3 仪器使用参数色谱柱：BEH C18柱（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相：色谱纯乙腈（A），0.1%甲酸水（B），采用梯度洗脱（见表1）；流速：0.2 mL/min；柱温：30℃；检测波长251 nm，运行10 min。

1.4 实验方法

1.4.1 EZL在鸡体肌肉、肝脏、肾脏体外代谢比较实验 分别准确称取肌肉、肝脏、肾脏组织匀浆2.0（±0.02）g于50 mL离心管中，加入400 μg/mL的EZL 50 μL，使组织中EZL的浓度均为10 mg/kg，分别于加药后0 min、10 min、20 min、30 min、50 min、1 h、2 h、3 h，按1.2的样品前处理方法进行处理，按1.3设置的仪器参数进行检测。常温加药后于孵育不同的时间处理，比较EZL含量的变化。同时以肌肉和肝脏组织作为比较，平行处理。

1.4.2 肾脏组织高温后添加EZL实验 称取肾脏匀浆组织2.0（±0.02）g于50 mL 离心管中置60℃水浴2 h后，添加适量EZL，按1.2的样品前处理方法进行处理，按1.3设置的仪器参数进行检测。同时室温条件下直接提取的做对照样品，比较两种处理方法的结果。

1.5 数据处理分别称取2.0（±0.02）g肾脏匀浆组织于50 mL 离心管中置60℃水浴2 h后，添加50 μL系列标准液浓度的EZL，使其终浓度分别为0、0.2、0.5、1、2、5、10 mg/kg，绘制标准曲线，用于计算肾脏组织中EZL的变化量。

表1 UPLC梯度洗脱条件Table 1 The gradientelution program of the UPLC-UV method

2 结果

2.1 肾脏组织高温后添加EZL实验本实验建立的仪器条件，以妥曲珠利亚砜（TSO）作为内标，色谱图峰形良好，可把EZL与代谢物M3很好的分开，能满足实验要求，标准液色谱图见图1。在前期实验中发现，室温条件下肾脏组织中添加一定量（0.5 mg/kg）的EZL，经过样品前处理，如图2A所示样品中几乎检测不到EZL，而检测到较多量的代谢物M3。然而，肾脏组织经60℃水浴2 h后，如图2B所示添加相同的量的EZL，则仅检测到EZL。我们分析，高温处理后使肾脏组织中负责代谢EZL的酶失活，间接证明肾脏是参与代谢EZL的主要器官之一。

图1 EZL与代谢物M3标准品色谱图Fig.1 Chromatogram of EZL (0.5μg/mL) and metabolite M3 (0.5μg/mL）standard solution

图2 肾脏组织经不同温度处理后添加EZL（0.5 mg/kg）的色谱图Fig.2 Chromatograms of the kidney tissue spiked with EZL(0.5 mg/kg) after the pretreatment at different temperature

2.2 肾脏组织添加EZL孵育不同时间后的代谢结果肾脏组织中添加EZL，室温条件下孵育不同时间后进行样品前处理，可以看到，加药充分涡旋后，直接提取（0 min），一部分EZL转化为M3，药物添加于肾脏组织20 min后，肾脏组织中EZL的量明显减少，几乎检测不到，而M3量随之增多（图3），孵育不同时间后提取，肾脏组织中EZL及代谢物M3的含量变化见图4。

图3 肾脏组织添加EZL (10 mg/kg )后不同孵育时间的色谱图Fig.3 Chromatograms of the kidney tissue spiked with EZL (10 mg/kg) at different incubation time points

图4 肾脏组织添加EZL孵育不同时间后EZL（A）及代谢物M3（B）的含量变化图Fig.4 Concentrations of EZL (A) and M3 (B) in the kidney tissue spiked with EZL (10 mg/kg)at different incubation tim

2.3 EZL在不同组织中的代谢比较以肌肉和肝脏样品作为对照，添加同肾脏组织匀浆中相同量的EZL，室温下孵育不同时间后，进行样品前处理，比较不同组织中EZL的代谢变化。如图5A所示，肌肉组织中添加EZL，室温下放置不同时间后处理，EZL的含量未见明显变化。如图5B所示肝脏组织中添加EZL，混匀后直接处理，未见EZL明显转化为M3，孵育30 min后再进行提取，仅检测到少量的M3。但相比肾脏组织，这种现象不明显，而且结果显示，肝脏组织匀浆加药后直接处理（0 min），未见EZL转化为M3。

3 讨论

肝脏是药物的主要和重要代谢器官，是药物生物转化的主要场所，是富含参与药物代谢的一个庞大的依赖细胞色素P450的混合功能氧化酶系统，大多数药物Ⅰ相和Ⅱ相代谢反应都是在肝药酶系统的参与下发生的[13,14]，以往对肝脏细胞微粒体中细胞色素家族酶P450已经进行过许多研究[15,16]，但是肝外组织，例如肾脏P450则研究得较少。细胞色素P450在大鼠肾脏中含量仅次于肝脏组织，而且肾脏P450反应底物与大鼠肝脏P450的反应底物不同[17]。

在样品前处理过程中发现，肾脏组织匀浆添加EZL后，常温条件下EZL很快被代谢为M3。同时，本研究比较EZL在鸡体肾脏、肝脏及肌肉组织中的体外代谢情况，在常温条件下3种组织中添加同质量的EZL，孵育20 min 后肾脏组织中除了M3几乎检测不到EZL，说明EZL在肾脏组织中很快被代谢为M3，而在肌肉中未发现这种现象。肝脏组织中添加EZL后立即处理未检测到M3，孵育30 min后检测到少量代谢物M3，因此我们推测M3主要在鸡肾脏中被代谢。为了进一步验证这一结果，我们将肾脏组织经60℃水浴处理后添加EZL，经样品前处理及孵育后未检测到M3，进一步说明肾脏中具有将EZL代谢为M3的酶，有关具体的代谢机制与过程有待进一步深入研究。

图5 肌肉（A）及肝脏（B）组织添加10 mg/kg沙咪珠利后孵育不同时间后色谱图Fig.5 Chromatograms of the liver tissue spiked EZL 10 mg/kg (A)and the muscle tissue spiked EZL 10 mg/kg(B) after different incubation time

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METABOLISM OF THE NOVEL TRIAZINE ANTICOCCIDIAL DRUG ETHANAMIZURIL IN CHICKEN TISSUES

ZHAO Xiao, ZHANG Li-fang, GUO Chun-na, WANG Chun-mei, WANG Xiao-yang, ZHANG Ke-yu,FEI Chen-zhong, WANG Mi, XUE Fei-qun, LIU Ying-chun

(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

S859.795

A

1674-6422（2017）04-0040-05

2016-12-13

新型动物专用药物的研制与应用（201303038）；中国农业科学院上海兽医研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（2016PT44；2016JB04）

赵晓，女，硕士研究生，兽药学专业

刘迎春，E-mail：liuyingchun@shvri.ac.cn；薛飞群，E-mail：fqxue@shvri.ac.cn