沙眼衣原体pORF5质粒蛋白抑制肿瘤坏死因子α诱导HeLa细胞凋亡

杨晓玉 邹燕 龚思露 卜继常 周洲 刘良专 李忠玉

421001湖南衡阳，南华大学医学院病原生物学研究所医学微生物学教研室 特殊病原体防控湖南省重点实验室

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白抑制肿瘤坏死因子α诱导HeLa细胞凋亡

杨晓玉 邹燕 龚思露 卜继常 周洲 刘良专 李忠玉

421001湖南衡阳，南华大学医学院病原生物学研究所医学微生物学教研室 特殊病原体防控湖南省重点实验室

目的探讨沙眼衣原体质粒蛋白pORF5对肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导HeLa细胞凋亡的影响。方法将含pORF5基因的慢病毒重组表达载体与辅助质粒共转染293T细胞制备慢病毒，慢病毒收集浓缩后再感染HeLa细胞，流式细胞仪分选获得pORF5基因稳定转染细胞株（pORF5-HeLa），同时建立空载体转染对照细胞株（对照HeLa）。将两种细胞株分别分为两组，一组用20 μg/L TNF-α处理（处理组），一组仅用新鲜培养基培养（未处理组），作用6 h，Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态，流式细胞仪检测细胞凋亡率，实时PCR检测凋亡相关蛋白Caspase3、Bcl-2和Bax mRNA表达水平，Western印迹检测Bax、Bcl-2蛋白表达水平。结果TNF-α处理细胞6 h后，Hoechst33258染色发现pORF5-HeLa和对照HeLa细胞中均可见不同程度的核固缩、碎裂，高亮蓝色凋亡小体；pORF5-HeLa细胞的凋亡率为（35.5±4.5）%，对照HeLa细胞凋亡率为（63.6±5.8）%，均显著高于相应未处理组［（9.5±1.5）%和（7.9±0.9）%，t值分别为13.53、32.36，均P＜0.01］。处理组pORF5-HeLa细胞中Bax和Caspase3 mRNA表达水平较处理组对照HeLa细胞分别降低72.8%和84.5%（t值分别为35.29，42.25，均P＜0.01），但Bcl-2 mRNA的表达水平显著高于处理组对照HeLa细胞（t=87.12，P＜0.01）。处理组pORF5-HeLa细胞中Bax蛋白表达水平亦显著低于处理组对照HeLa细胞（t=17.58，P＜0.01），而Bcl-2蛋白表达水平较对照HeLa细胞增加6.8倍，差异有统计学意义（t=18.93，P＜0.01）。结论pORF5可能通过增强抗凋亡蛋白Bcl-2降低促凋亡蛋白Caspase3和Bax的表达，抑制TNF-α诱导的HeLa细胞凋亡。

沙眼衣原体；细胞凋亡；肿瘤坏死因子α；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；bcl-2相关X蛋白质；B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白；pORF5质粒蛋白

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）是性传播疾病的主要病原体之一。Ct感染病程隐匿，往往不易被发觉而延误治疗。Ct严格细胞内寄生，为从宿主细胞中获得营养物质并顺利完成其在细胞内的发育周期。已有研究报道，衣原体感染可通过丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶（MAPK/ERK）途径诱导高迁移率族蛋白1释放进而抑制细胞凋亡，也可通过阻止线粒体细胞色素C释放和抑制半胱天冬酶Caspase的活性而抑制细胞凋亡［1-4］。pORF5是由Ct质粒基因编码并主要定位于感染宿主细胞胞质的一种分泌性效应蛋白［5］，既往研究证实pORF5质粒蛋白与Ct致病密切相关［6-11］。为研究pORF5质粒蛋白是否具有抗凋亡作用，本研究将构建成功的慢病毒表达载体和空载体分别与辅助质粒共同包装重组慢病毒，建立pORF5基因稳定转染细胞株和对照细胞株，测定肿瘤坏死因子α（TNF-α）作用后凋亡相关蛋白/基因的表达水平，分析pORF5质粒蛋白对HeLa细胞凋亡的影响，为进一步阐明Ct的致病机制提供依据。

材料与方法

一、主要试剂和细胞

慢病毒载体系统（pMDlg-pRRE、pRsv-REV、pMD2G，PLenO-DCE）为上海英为信生物技术有限公司产品；膜联蛋白Ⅴ-APC/7-AAD（AnnexinⅤ-APC/7-AAD）双染细胞凋亡检测试剂盒为美国eBioscience公司产品；RPMI1640为美国HyClone公司产品；LipofectamineTM2000转染试剂和Trizol总RNA抽提试剂盒为美国Invitrogen公司产品；HeLa细胞、293T细胞株来自上海中国科学院细胞库。

二、慢病毒的包装与稳定转染细胞株的构建

将已构建成功含pORF5基因的重组慢病毒表达载体PLenO-DCE/pORF5和空载体PLenO-DCE分别与pMDlg-pRRE、pRsv-REV、pMD2G辅助质粒共转染293T细胞48 h，收集病毒上清并进行浓缩与纯化，采用倍比稀释法检测病毒滴度。将纯化后的慢病毒感染HeLa细胞48 h，流式分选技术筛选稳定转染细胞株，分别命名为pORF5-HeLa细胞和对照HeLa细胞，采用Western印迹对pORF5蛋白的表达进行鉴定。

三、细胞培养及处理

将pORF5-HeLa细胞和对照HeLa细胞接种于6孔细胞培养板，37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后分别分成两组，第1组为处理组：细胞培养基中加入终浓度为20 μg/L的凋亡诱导剂TNF-α培养6 h；第2组为未处理组，直接更换新鲜细胞培养基。实验重复3次取均值。

四、细胞凋亡检测

pORF5-HeLa细胞和对照HeLa经上述方法处理后，分别用4%的甲醛固定10 min，PBS洗涤后再加入Hoechst 33258（终浓度为10 mg/L）染色30 min，最后用PBS洗涤、封片，干燥，荧光显微镜下观察。同时收集处理后的pORF5-HeLa细胞和对照HeLa细胞，预冷的PBS缓冲液洗涤后，1×结合缓冲液调整细胞数为1×106个/ml，然后将细胞分成4组，第1组为空白对照组，细胞不加任何试剂染料；第2组细胞加入Annexin V-APC；第3组细胞加入7-AAD，第2组和第3组作为单染对照组；第4组细胞同时加入Annexin V-APC和7-AAD。轻轻混匀并避光孵育15 min，2 h内流式细胞仪分析凋亡率。

五、实时PCR检测Caspase3、Bcl-2和Bax mRNA表达

收集经TNF-α处理的pORF5-HeLa细胞和对照HeLa细胞，参照Trizol总RNA抽提试剂盒说明书提取细胞总RNA。取1 μg总RNA作为模板，M-MuLV反转录酶将RNA反转录得到cDNA，以cDNA为模板，应用SYBR Green I荧光染料嵌合法进行实时PCR，测定凋亡相关蛋白Caspase3和Bax mRNA的表达，实验以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内源性对照，引物序列见表1。实时PCR反应条件为94℃预变性10 min，进入94℃变性20 s，65℃退火30 s，72℃延伸45 s，40个循环后，分别测定各种目的基因和内参基因GAPDH的PCR产物荧光强度达到一定阈值所需要的循环数（Ct值），采用2-△△Ct方法计算Caspase3、Bcl-2和Bax基因的相对表达量。

六、Western印迹鉴定Bax和Bcl-2蛋白表达

收集经TNF-α处理的pORF5-HeLa和对照HeLa细胞，PBS洗涤后加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液充分裂解细胞，离心取上清进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析，将分离后的蛋白转移到二氟化树脂（PVDF）膜上，PVDF膜经5%脱脂奶粉封闭后，加入兔抗Bax和兔抗Bcl-2抗体，4℃冰箱孵育过夜，0.05%TBST洗涤后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔IgG，最后加入ECL显色，胶片曝光显影定影。Image Quant软件分析蛋白质条带的灰度值，计算蛋白质表达的相对强度。

七、统计学分析

运用SPSS13.0软件进行统计学分析，所有数据均采用±s表示，两组间均数比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、慢病毒包装及pORF5基因稳定转染HeLa细胞株的建立

将慢病毒重组表达载体与辅助质粒共转染到293T细胞48 h后，由于慢病毒载体携带GFP报告基因，荧光显微镜下可见细胞发出绿色荧光（图1）。以不同稀释度的慢病毒感染293T细胞，荧光显微镜下可见随着病毒浓度的降低，绿色荧光细胞数逐渐减少（图1A～1D）。根据公式计算出慢病毒滴度为1.5×109TU/ml。慢病毒感染HeLa细胞扩大培养后，流式细胞仪多次筛选获得稳定转染细胞株，纯度达到95%以上（图1E）。

表1 基因实时PCR引物序列

二、稳定转染HeLa细胞中pORF5质粒蛋白表达的鉴定

Western印迹分析发现，pORF5-HeLa细胞在相对分子质量28 000处出现一条特异性条带，对照HeLa细胞无条带出现（图2）。

三、pORF5对TNF-α诱导HeLa细胞凋亡的影响

pORF5-HeLa和对照HeLa细胞经TNF-α处理后，Hoechst染色结果发现两组细胞均出现不同程度的核固缩、碎裂，高亮蓝色凋亡小体（图3）。流式细胞仪检测显示，处理组pORF5-HeLa和对照HeLa细胞凋亡率分别为（35.5±4.5）%和（63.6±5.8）%，显著高于相应未处理组［（9.5±1.5）%和（7.9±0.9）%，t值分别为13.53、32.36，均P＜ 0.01］，但TNF-α处理后pORF5-HeLa细胞凋亡率较对照HeLa细胞凋亡率降低28.1%（t=7.05，P＜0.01）。见表2。

四、TNF-α处理后Hela细胞Bax、Caspase3和Bcl-2 mRNA表达

由表2可以看出，TNF-α处理后两种细胞Bax和Caspase3 mRNA水平均显著高于相应未处理组（均P＜0.01）；处理组pORF5-HeLa细胞中Bax和Caspase3 mRNA表达水平较处理组对照HeLa细胞分别降低72.8%和84.5%，差异有统计学意义（t值分别为35.29、42.25，均P＜0.01），但 Bcl-2 mRNA表达水平显著高于处理组对照HeLa细胞（t=87.12，P＜ 0.01）。

图1 慢病毒包装及稳定转染Hela细胞株的构建 采用倍比稀释法稀释慢病毒，然后以不同稀释度的慢病毒感染293T细胞，荧光显微镜下观察病毒感染情况。1A～1D：分别为慢病毒1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000稀释；1E：稳定转染的HeLa细胞株

图2 Western印迹鉴定pORF5蛋白的表达 1：对照HeLa细胞；2：pORF5-HeLa细胞

图3 Hoechst染色观察凋亡细胞形态 pORF5-HeLa和对照HeLa细胞经TNF-α处理6h，Hoechst染色观察细胞凋亡情况，可见两组细胞均出现不同程度的核固缩、碎裂和高亮蓝色凋亡小体等细胞凋亡现象（箭头）

五、Hela细胞Bax和Bcl-2蛋白表达水平

TNF-α处理后pORF5-HeLa细胞中Bax蛋白表达水平（1.12±0.15）显著低于对照HeLa细胞组（7.95± 0.62）（t=17.58，P＜ 0.01），而Bcl-2蛋白表达水平（7.88±0.99）较对照HeLa细胞组（1.01±0.23）增加6.8倍，差异有统计学意义（t=18.93，P＜0.01）。见图4。

讨 论

pORF5体外能诱导白介素（IL）-1β、IL-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α等多种炎症因子产生，体内能诱导小鼠生殖道免疫病理损伤［7-10］，是Ct重要的毒力蛋白。为探讨pORF5质粒蛋白对细胞凋亡的影响，我们用慢病毒系统建立高表达pORF5蛋白的稳定转染HeLa细胞株。由于慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞，可实现在细胞中特异而稳定的基因表达，为在细胞中快速而高效地研究pORF5基因功能或pORF5基因表达产物功能提供了有利条件。

细胞凋亡是宿主抗病原体感染的重要防御机制。除了在正常的生长发育和维持组织内稳态方面起重要作用外，细胞凋亡可激活炎症反应，限制病原体传播。Ct为一种细胞内寄生菌，为顺利完成其在细胞内的发育周期，Ct通过多种机制抑制细胞凋亡［1-4］。为研究pORF5质粒蛋白是否具有抗凋亡作用，本研究用凋亡诱导剂TNF-α刺激pORF5稳定转染的HeLa和对照HeLa细胞，结果发现，TNF-α能诱导pORF5-HeLa和对照HeLa细胞凋亡，但pORF5-HeLa细胞凋亡率显著低于对照HeLa细胞，说明pORF5能抑制TNF-α介导的细胞凋亡。

Bcl-2是细胞凋亡信号转导途径中关键的凋亡调节因子［12］，主要通过改变线粒体膜对一些离子、小分子或蛋白质的通透性而参与细胞凋亡的调控。Bax为促凋亡蛋白，当细胞受到凋亡信号刺激后，Bax可诱导线粒体释放细胞色素C，激活Caspase3，而Caspase3是天冬氨酸特异性半胱氨酸酶家族关键的下游成员，Caspase3激活后可引起细胞凋亡。抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白的比率决定了细胞对凋亡信号的敏感性［13］。本研究发现TNF-α处理细胞后，pORF5-HeLa细胞中促凋亡因子Bax和Caspase3 mRNA表达水平较对照HeLa细胞显著减少，Bax蛋白表达水平也显著低于对照组，而抗凋亡因子Bcl-2蛋白表达水平显著增加，说明pORF5质粒蛋白能调节凋亡相关蛋白的表达，通过上调抗凋亡蛋白和下调促凋亡蛋白表达，从而实现抗细胞凋亡作用。

我们利用慢病毒载体系统，建立了pORF5基因稳定转染的HeLa细胞系和对照HeLa细胞系，稳定细胞转染细胞经TNF-α处理后，发现pORF5可以诱导HeLa细胞中Bcl-2蛋白表达升高，同时降低Bax和Caspase3的mRNA表达水平，初步证实Ct质粒蛋白pORF5可抑制TNF-α介导的细胞凋亡。由于细胞凋亡是多蛋白严格控制的过程，pORF5质粒蛋白如何抑制细胞凋亡，凋亡抑制后又如何参与Ct感染性疾病的的发生和发展尚待进一步研究。

表2 两组HeLa细胞凋亡率以及Bax、Caspase3和Bcl-2基因mRNA表达水平比较（±s）

表2 两组HeLa细胞凋亡率以及Bax、Caspase3和Bcl-2基因mRNA表达水平比较（±s）

注：n=3。t1、P1：pORF5-HeLa细胞与对照HeLa细胞之间比较；t2、P2：同一种细胞TNF-α 处理组与未处理组比较。a：pORF5-HeLa细胞比较结果；b：对照HeLa细胞比较结果。TNF-α：肿瘤坏死因子α

组别pORF5-HeLa细胞对照HeLa细胞t1 P1 t2 P2凋亡率（%）TNF-α 处理35.5±4.5 63.6±5.8 12.85＜0.01 13.53a＜0.01a未处理9.5±1.5 7.9±0.9 1.99＞0.05 32.36b＜0.01b Bax mRNA TNF-α 处理1.58±0.25 5.81±0.48 35.29＜0.01 51.13a＜0.01a未处理0.45±0.09 0.49±0.10 2.43＞0.05 87.25b＜0.01b Caspase3 mRNA TNF-α 处理1.27±0.14 8.21±1.80 42.25＜0.01 10.05a＜0.01a未处理0.61±0.12 0.73±0.15 1.58＞0.05 68.34b＜0.01b Bcl-2 mRNA TNF-α处理7.04±0.12 0.95±0.10 87.12＜0.01 75.24a＜0.01a未处理1.21±0.51 0.92±0.91 22.65＞0.05 1.68b＞0.05b

图4 Western印迹分析Bax和Bcl-2蛋白表达 1：pORF5-HeLa细胞；2：对照HeLa细胞

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Inhibitory effect of Chlamydia trachomatis plasmid-encoded protein pORF5 on HeLa cell apoptosis induced by tumor necrosis factor-alpha

Yang Xiaoyu,Zou Yan,Gong Silu,Bu Jichang,Zhou Zhou,Liu Liangzhuan,Li Zhongyu
Institute of Pathogenic Biology,Medical College,University of South China,Hunan Provincial Key Laboratory for Special Pathogens Prevention and Control,Hengyang,421001,China

Li Zhongyu,Email:lzhy1023@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate inhibitory effect ofChlamydia trachomatisplasmid-encoded protein pORF5 on HeLa cell apoptosis induced by tumor necrosis factor-alpha（TNF-α）.MethodsThe recombinant lentiviral expression vector containing pORF5 gene and helper plasmids were co-transfected into 293T cells to prepare the recombinant lentivirus.Then,the lentivirus particles were collected and concentrated,and used to infect HeLa cells.Flow cytometric screening identified stable pORF5-expressing HeLa（pORF5-HeLa）cells.Meanwhile,the empty plasmid was transfected into HeLa cells to prepare control HeLa cells.The two cell lines were both divided into two subgroups to be treated with 20 μg/L TNF-α and fresh culture medium respectively for 6 hours.Then,Hoechst 33258 staining was performed to observe morphological changes of apoptotic cells,flow cytometry to detect cell apoptosis,real-time PCR to measure the mRNA expression of Caspase3,Bax and Bcl-2,and Western blot analysis to determine the protein expression of Bax and Bcl-2.ResultsAfter 6-hour treatment with TNF-α,Hoechst 33258 staining showed variable degrees of karyopyknosis and karyorrhexis,and highly-refractive blue apoptotic bodies in the pORF5-HeLa cells and control HeLa cells.The pORF5-HeLa cells and control HeLa cells both showed significantly higher apoptosis rate in the treated subgroup than in the untreated subgroup（pORF5-HeLa cells:35.5%±4.5%vs.9.5%±1.5%,t=13.53,P＜0.01;control HeLa cells:63.6%±5.8%vs.7.9%±0.9%,t=32.36,P＜ 0.01）.Compared with treated control HeLa cells,treated pORF5-HeLa cells showed significant decreases in mRNA expression of Bax（72.8%）and Caspase 3（84.5%）（t=35.29,42.25,respectively,bothP＜ 0.01）,as well as in Bax protein expression（t=17.58，P＜ 0.01）,but significant increases in Bcl-2 mRNA and protein（6.8 times）expression（t=87.12,18.93,respectively,bothP＜0.01）.ConclusionpORF5 plasmid protein can inhibit TNF-α-induced HeLa cell apoptosis likely by increasing the expression of anti-apoptotic protein bcl-2 and decreasing the expression of pro-apoptotic proteins Caspase-3 and Bax.

Chlamydia trachomatis;Apoptosis;Tumor necrosis factor-alpha;Caspase3;bcl-2-Associated X Protein;B-cell lymphoma/Leukemia-2;pORF5 plasmid protein

李忠玉，Email：lzhy1023@hotmail.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.05.007

国家自然科学基金（31470277、81102230、31300156）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（31470277,81102230,31300156）

2016-11-25）

（本文编辑：尚淑贤）