金宝肾片质量标准研究

王曙东，钱文慧，廖 欣，易 伟，苏 华

（中国人民解放军南京军区南京总医院制剂科，江苏 南京 210002）

金宝肾片质量标准研究

王曙东，钱文慧，廖 欣，易 伟，苏 华

（中国人民解放军南京军区南京总医院制剂科，江苏 南京 210002）

目的建立金宝肾片的质量标准。方法采用薄层色谱（TLC）法对金宝肾片中的大黄素进行定性鉴别，并采用高效液相色谱法测定金宝肾片中卡托普利及大黄酸、大黄素、大黄酚的含量，并进行方法学验证。结果大黄素的薄层色谱斑点清晰，分离度好，阴性对照无干扰。卡托普利质量浓度在 18．964 ～94．820 g／mL（R2＝0．999 8）范围内与峰面积线性关系良好，平均加样回收率为 96．97% （n ＝9）；大黄酸、大黄素、大黄酚检测质量浓度分别在 2．19 ～17．52 g／mL（R2＝ 0．999 9），1．47 ～ 11．76 g／mL （R2＝0．999 9），6．97 ～55．76 g ／mL（R2＝ 0．999 9）范围内与峰面积线性关系良好，平均加样回收率分别为 102．91% ，103．03% ，102．06% （n ＝9）。结论该质量标准方法可行，专属性强，重复性好，可用于该制剂的质量控制。

金宝肾片；卡托普利；大黄酸；大黄素；大黄酚；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法

金宝肾片为我院与解放军肾脏病研究所共同研制的院内制剂，其主要有效成分为卡托普利及大黄提取物，有升清消浊、调节代谢、保护肾功能、降低血压、纠正脂质代谢紊乱的功效，主要用于治疗各种原因引起的慢性肾功能衰竭症，尤其能改善高血压、心力衰竭等并发症，临床疗效较好。卡托普利为经典的血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI），降压疗效确切[1]。大黄提取物包括大黄酸、大黄素、大黄酚等，近年来因其良好的抗菌、消炎、抗氧化、调节糖代谢的药理活性而被临床广泛用于各种肾炎、糖尿病肾病、慢性肾功能不全的治疗[2－4]。为了有效控制该制剂的质量，保障药品安全有效，本研究中采用薄层色谱（TLC）法对金宝肾片中的大黄素进行定性鉴别，并采用高效液相色谱（HPLC）法对金宝肾片中的有效成分卡托普利及大黄酸、大黄素、大黄酚的测定方法进行研究。现报道如下。

1 仪器与试药

1．1 仪器

Agilent 1100型高效液相色谱仪(安捷伦科技有限公司；KQ－250DB型数控超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）；FA1604S型电子天平（上海天平仪器厂）；AE240型电子分析天平（梅特勒－托利多仪器有限公司）。

1．2 试药

卡托普利对照品（批号为100318－200602，含量为99．5% ），大黄素对照品（批号为 110756 － 200206，含量为 100．0%），大黄酸对照品（批号为 110757－200110，含量为 100．0%），大黄酚对照品（批号为 110796－201319，含量为99．5%），均购于中国食品药品检定研究院；薄层层析硅胶G（青岛海洋化工厂）；甲醇（色谱纯，美国Tedia公司）；金宝肾片（医院自制制剂，批号分别为 140730，140818，141017，规格为每片 0．25 g）；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 大黄素鉴别(TLC法)

取本品10片，除去薄膜衣，研细，称取2 g，精密称定，加20%硫酸20 mL，二氯甲烷20 mL，加热回流1 h，放冷，用棉花过滤至分液漏斗中，分取二氯甲烷层，另置；水层再加二氯甲烷提取3次，每次20 mL，合并二氯甲烷提取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。另取大黄素对照品，加甲醇制成每1 mL含0．5 mg的对照品溶液。按处方比例称取除大黄外的其余辅料及卡托普利，研细，按本品制备工艺及供试品溶液制备方法制成阴性对照品溶液。照2010年版《中国药典(一部)》附录ⅥB薄层色谱法试验，吸取上述3种溶液各20 μL，精密量取，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚（30～60℃）－甲酸乙酯 －甲酸（15∶5∶1）上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干。供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应位置上，显相同颜色的黄色斑点；氨蒸气熏后，斑点变为红色，同时阴性对照无此斑点，表明处方中其他辅料及卡托普利对大黄的鉴别无干扰，色谱图见图 1。共取 3批（批号分别为 140730，140818，140909）样品，进行验证试验，该方法鉴别结果均呈正反应，表明该方法准确可行。

图1 薄层色谱图

2．2 检查

3批样品均符合2010年版《中国药典（一部）》附录Ⅰ“片剂”项下有关检查的各项规定。2．3 卡托普利含量测定(HPLC法)2．3．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Lichrospher C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流动相：甲醇－0．1%磷酸溶液－四氢呋喃（30∶70∶0．15)；检测波长：215 nm；柱温：40 ℃；流速：1 mL ／min；进样量：20 μL。理论板数按卡托普利峰计算应不得低于20 000。

2．3．2 溶液制备

取卡托普利对照品适量，称取50 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，制成卡托普利对照品贮备液（质量浓度为 0．474 1 g／L）；精密量取对照品贮备液3 mL，置25 mL容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。取本品适量，除去薄膜衣，用研钵研细，称取0．25 g，精密称定，置平底烧瓶中，加流动相100 mL，称定质量，50℃加热回流2 h，放冷，用流动相补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。按处方比例和样品制备工艺制成不含卡托普利的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2．3．3 测定法

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算峰面积，即得。本品含卡托普利应为标示量的85．0% ～115．0%。

2．3．4 方法学考察

专属性试验：精密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照品溶液各20 μL，按拟订方法进行测定，记录色谱图。由图2可见，供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应保留时间处，均有与对照品溶液色谱相对应的色谱峰出现，而阴性对照品溶液则无相应峰出现，表明阴性对照无干扰。

线性关系考察：分别精密量取对照品贮备液1．0，2．0，3．0，4．0，5．0 mL，置 25 mL 容量瓶中，用流动相稀释至刻度，依法进行测定，以质量浓度（X）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程 Y＝22 296 X－7．13，R2＝0．999 8（n＝5）。结果表明，卡托普利质量浓度在 0．018 964～0．094 820 g／L 范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取对照品贮备液20 μL，按拟订色谱条件连续进样5次。结果卡托普利峰面积的RSD为0．83%（n＝5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（批号为130818）样品，依法制备供试品溶液，进样测定，在常温下分别于0，1，2，4，8 h时进样，记录卡托普利峰面积。结果的 RSD为1．10%（n＝5），表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批（批号为130818）样品5份，依法制备供试品溶液，进样测定。结果的 RSD为0．51%（n＝5），表明方法重复性良好。

图2 卡托普利含量测定高效液相色谱图

加样回收试验：取已知含量的样品（批号为140818），精密称取 0．012 5 g，共 9 份，分别置平底烧瓶中，按低、中、高3个质量浓度分别精密加入对照品贮备液3，5，7 mL，依法制备供试品溶液。精密吸取上述供试品溶液各20 μL注入液相色谱仪，测定含量，计算回收率。结果见表1。

2．3．5 样品含量测定

取 3 批（批号分别为 140730，140818，140909）样品，依法制备供试品溶液，在拟订色谱条件下测定含量。结果3 批样品中卡托普利含量分别为 4．86，4．82，4．93 mg。2．4 大黄酸、大黄素、大黄酚含量测定(HPLC法)2．4．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Lichrospher C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 －0．1% 磷酸溶液（70 ∶30）；检测波长：254 nm；柱温：25 ℃；流速：1 mL ／min；进样量：20 μL。理论板数分别按大黄酸峰、大黄素峰、大黄酚峰计算应不得低于20 000。

2．4．2 溶液制备

精密称取大黄酸、大黄素、大黄酚对照品适量，置200 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制成含大黄 酸 21．90 μg ／mL、 大 黄 素 14．70 μg ／mL、 大 黄 酚6．97 μg／mL的对照品混合贮备液；精密吸取对照品贮备液4 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。取[装量差异]项下的本品适量，用研钵研细，精密称取0．15 g置平底烧瓶中，加甲醇50 mL，称定质量，加热回流2 h，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。按照该药的处方称取不含大黄提取物的阴性样品，按供试品溶液的制备方法制备阴性对照品溶液。

表1 卡托普利加样回收试验结果(n＝9)

2．4．3 测定法

精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法计算峰面积，即得。本品每粒含大黄酸、大黄素、大黄酚总量不得低于3．0 mg。

2．4．4 方法学考察

专属性试验：精密吸取对照品溶液、供试品溶液与阴性对照品溶液各20 μL，按拟订色谱条件进行测定，记录色谱图。由图3可见，供试品溶液色谱中，在与对照品溶液色谱相应保留时间处有相同色谱峰，而阴性对照品溶液则无相应峰出现，表明阴性对照品无干扰。

图3 大黄类成分含量测定高效液相色谱图

线性关系考察：分别精密吸取混合对照品贮备液1．0，2．0，4．0，6．0，8．0 mL，置 10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，依法进行测定，以对照品质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程。结果见表2。

表2 大黄酸、大黄素、大黄酚线性关系考察结果

精密度试验：精密吸取混合对照品溶液20 μL，按拟订色谱条件连续进样5次。结果大黄酸、大黄素、大黄酚峰面积的 RSD 分别为 0．51%，0．40%，0．46%（n＝5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批（批号为140818）样品，依法制备供试品溶液并进行测定，在常温下分别于0，1，2，4，8 h时进样测定。结果大黄酸、大黄素、大黄酚峰面积的 RSD 分别为 1．29% ，0．13%，0．05% （n ＝ 5），表明供试品溶液在8 h内稳定性良好。

重复性试验：取同一批（批号为140818）样品5份，依法制备供试品溶液并进行测定。结果大黄酸、大黄素、大黄酚峰面积的 RSD 分别为 0．59% ，0．61% ，1．05%（n＝5），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密称取已知含量的金宝肾片样品（批号为 140818）0．075 g，共 9 份，分别置平底烧瓶中，按低、中、高3个质量浓度分别精密加入混合对照品贮备液6，10，15 mL，依法制备供试品溶液。精密吸取上述溶液各20 μL注入液相色谱仪，测定含量，计算回收率。结果见表3。

2．4．5 样品含量测定

取 3 批（批号分别为 140730，140818，140909）金宝肾片，依法制备供试品溶液，进样测定，结果见表4。综合3批样品测定结果，确定本品含卡托普利应为标示量的85% ～115%，每片含大黄酸、大黄素、大黄酚总量不得低于 3．0 mg。

表3 大黄酸、大黄素、大黄酚加样回收试验结果(n＝9)

表4 样品中大黄酸、大黄素、大黄酚含量测定结果（mg）

3 讨论

3．1 有效成分选择

金保肾片的处方主要为卡托普利及大黄提取物。大黄提取物中大黄酸、大黄素、大黄酚因具有良好的抗菌、消炎、抗氧化、调节糖代谢的药理活性而被广泛用于各种肾炎及肾病的治疗[5－8]。大黄提取物中芦荟大黄素和大黄素甲醚的药效则与肾病的治疗相关性不是很大，其中芦荟大黄素的功效则侧重于心血管保护，保肝，抗肿瘤及泻下，大黄素甲醚则侧重于抗缺血、抗缺氧脑损伤等神经保护作用。因此，在制订金保肾片质量标准时，选择与肾病治疗相关性较大的卡托普利及大黄酸、大黄素、大黄酚作为质控指标。卡托普利为甲巯丙脯酸，呈弱酸性，且对光、热不稳定；大黄酸、大黄素、大黄酚属于蒽醌类衍生物，结构中含有多个酚羟基，呈弱酸性，但大黄酸、大黄素、大黄酚的极性比卡托普利更强。鉴于两类成分的性质差异，尤其是卡托普利的不稳定性，需分开检测。本研究中分别建立了金宝肾片中两类有效成分的含量测定方法。

3．2 检测波长选择

分别测定了金宝肾片中两类成分的最大吸收波长。检测发现，卡托普利最大吸收为末端吸收，参考2010年版《中国药典》及文献[9－11]，选取吸光度合适的215 nm为检测波长；分别对大黄酸、大黄素、大黄酚在200～400 nm波长内进行紫外扫描，发现3个成分的最大吸收均为末端吸收，最终选择大黄酸、大黄素、大黄酚对照品吸光度较大的254 nm为检测波长。

3．3 流动相选择

根据两类有效成分化学性质的差异分别进行了流动相考察。根据卡托普利的酸性，发现流动相pH为2．6～2．8时，样品较稳定。因此，试用了不同类别的流动相，发现0．01 mol／L磷酸二氢钠－甲醇－乙腈（70∶25∶5）样品峰形不佳，且分离度不好；甲醇－0．1%磷酸溶液（70∶30）出峰时间和分离度均不好；甲醇 －0．1%磷酸 －四氢呋喃（28∶72∶0．15），样品峰形及分离度均较好。故选择其为卡托普利的最佳流动相。首先根据前期研究的基础，选择甲醇 －0．2%磷酸溶液（75∶25）为流动相，发现大黄酸、大黄素、大黄酚的出峰时间及分离度较好，但大黄酚的峰形拖尾；后采用甲醇－0．5%醋酸（75 ∶25）及甲醇 － 0．5%醋酸（70 ∶30）流动相体系，发现大黄酚峰形拖尾未改善，同时大黄酸也出现拖尾；进一步选择甲醇 －0．1%磷酸溶液（70∶30）体系，大黄酸、大黄酚峰形均较好。因此，采用甲醇－0．1%磷酸溶液（70 ∶30）为流动相。

3．4 提取方法及条件选择

金宝肾片中卡托普利的提取方法，参考药典及文献[12]进行了提取方法考察，发现由于卡托普利对热不稳定，因此回流的提取方式比超声更稳定，同时回流的温度不能过高，50℃提取2 h效率最高。大黄有效成分的提取方法参考文献[13－14]，发现采用补足减重法在60℃回流提取大黄酸、大黄素、大黄酚2 h的提取效率较高，操作简便，重复性较好。

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Quality Standard of Jinbaoshen Tablets

Wang Shudong,Qian Wenhui,Liao Xin,Yi Wei,Su Hua
(Department of Preparation Division,Nanjing General Hospital of Nanjing Military Command of PLA,Nanjing,Jiangsu,China 210002)

Objective To establish the quality standard of the Jinbaoshen Tablets．M ethods The emodin in Jinbaoshen Tablets was qualitative identified by thin layer chromatography(TLC)method．The contents of captopril,rhein,emodin and chrysophanol in Jinbaoshen Tablets were determined by HPLC and then carried out the verification methodology．Results The TLC spot of emodin were clear,separation was good,and negative control without interference．The liner range of captopril was 18．964 － 94．820 μg ／mL(R2＝ 0．999 8),and the average recovery was 96．97%(n ＝ 9)．The liner range of rhein,emodin and chrysophanol were 2．19 － 17．52 μg ／mL(R2＝ 0．999 9),1．47 － 11．76 μg ／mL(R2＝0．999 9),6．97 － 55．76 μg／mL(R2＝ 0．999 9),and the average recoveries was 102．91%,103．03%,102．06%(n ＝ 9),respectively．Conclusion The established method for the quality standard of the Jinbaoshen Tablets is feasible,has strong specificity and good repeatability,which can be used for the quality control of the preparation．

Jinbaoshen Tablets;captopril;rhein;emodin;chrysophanol;quality standard;TLC;HPLC

R284．1

A

1006－4931(2017)19－0014－05

10．3969 ／j．issn．1006 － 4931．2017．19．004

全军医疗机构制剂标准提高科研专项课题重点项目[13ZJZ13]。

王曙东（1965－），男，博士研究生，主任药师，研究方向为医院制剂的研究发，(电子信箱)nzwsd860161＠163．com。

苏华（1978－），女，硕士研究生，主管药师，研究方向为医院制剂和靶向制剂，（电话）025－80860166（电子信箱）suhuash＠ sina．com。

2016－05－18)