卤素水分测定法结合高效液相色谱法优选妇科灌肠液提取工艺的研究

刘凤乐 ，邱 逊 ，高文全 ，王蕊蕊 ，赵桂芬 ，杨 磊 ，赵爱梅

（1.云南省大理白族自治州中医医院，云南 大理 671000； 2.云南省大理市第一人民医院，云南 大理 671000）

卤素水分测定法结合高效液相色谱法优选妇科灌肠液提取工艺的研究

刘凤乐1，邱 逊1，高文全1，王蕊蕊1，赵桂芬1，杨 磊2，赵爱梅1

（1.云南省大理白族自治州中医医院，云南 大理 671000； 2.云南省大理市第一人民医院，云南 大理 671000）

目的优选妇科灌肠液的提取工艺。方法采用卤素水分测定法和高效液相色谱（HPLC）法，以浸膏得率和盐酸小檗碱含量为指标，通过正交试验设计，对提取工艺中加水量（A）、提取时间（B）、提取次数（C）3个因素进行考察，以优选最佳提取工艺。结果最佳提取工艺条件为加10倍量水，煎煮3次，每次1 h。结论该方法可作为妇科灌肠液的提取工艺。

妇科灌肠液；正交试验；提取工艺；盐酸小檗碱；浸膏得率

妇科灌肠液是根据云南省大理白族自治州中医医院临床验方研制的院内中药制剂，由黄柏、苦参、鱼腥草、丹参、川芎、败酱草、薏苡仁等中药组方，具有活血化瘀、清热利湿、理气止痛之功效，临床应用10多年，主要用于治疗急慢性盆腔炎。方中黄柏为君药，其味苦，性寒，归肾、膀胱、大肠经，功能清热燥湿、泻火解毒、除骨蒸，用于治疗湿热带下、热淋涩痛、湿热泻痢、黄疸、疮疡肿毒，湿疹瘙痒等症[1]。大量研究表明，黄柏具有广泛的抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌等生物学和药理活性，盐酸小檗碱是其主要有效成分之一[2－6]。本试验中参考文献[7－8]，以浸膏得率、盐酸小檗碱含量为提取工艺指标，采用正交试验设计优选其提取工艺[9－10]，为研究制剂的成型工艺提供试验依据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 1260型高效液相色谱仪，配G1311B四元梯度泵，G1329B自动进样器、G1316A柱温箱，G1315D二极管阵列检测器(美国安捷伦科技有限公司）；AR423DCN型电子天平，DV215CD型电子分析天平，MB45型卤素水分测定仪（美国奥豪斯仪器有限公司）；C21－ST2118型电磁炉（广东美林生活电器有限公司）；PS－30型超声波清洗仪（深圳市洁康洗净电器有限公司）。

1.2 试药

盐酸小檗碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号为110713－201212）；中药材购于云南白药集团股份有限公司中药饮片分公司，经云南省大理白族自治州中医医院赵爱梅副主任药师鉴定，均符合2015年版《中国药典（一部）》标准规定；乙腈（色谱纯，美国天地公司）；甲醇（色谱纯，美国飞世尔公司）；磷酸（分析纯，天津福晨化学试剂厂）；水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法与结果

2.1 盐酸小檗碱含量测定

2.1.1 色谱条件[11－12]

色谱柱：Zorbax SB －C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A） －0.2% 磷酸水溶液（B），梯度洗脱，0～24 min，10% ～50%A；流速：1 mL ／min；柱温：30℃；检测波长：265 nm；进样体积：5 μL。

2.1.2 溶液制备

对照品溶液：称取盐酸小檗碱对照品9.97 mg，精密称定，置 10 mL容量瓶中，加盐酸 －甲醇（1∶100）定容至刻度，摇匀，制成对照品母液。再吸取对照品母液1 mL，置 10 mL容量瓶中，加盐酸 －甲醇（1∶100）定容至刻度，摇匀，制成含量为0.099 7 g／mL的对照品溶液。

供试品溶液：依处方组成配比称取药材，平行称取9 份，浸泡 30 min，按 L9（34）试验表进行煎煮提取，提取液滤过，合并滤液，浓缩，定容，作为样品溶液。精密吸取样品溶液10 mL，至具塞磨口玻璃瓶中，再加入15 mL盐酸 － 甲醇（1 ∶100），振摇，称定质量，超声 30 min，再称定质量，补足减失的质量。吸取上清液，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得各提取液的供试品溶液。

阴性对照品溶液：精密吸取缺黄柏的阴性样品溶液10 mL，按供试品溶液制备方法制备缺黄柏的阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

专属性试验：精密吸取 2.1.2项下 3种溶液各5 μL，照 2.1.1 项下色谱条件进样测定。结果供试品溶液色谱中盐酸小檗碱与相邻色谱峰分离度＞1.5，理论板数按盐酸小檗碱计算不低于50 000，阴性对照无干扰，详见图1。

线性关系考察：精密吸取 2.1.2项下对照品溶液(0.099 7 g ／mL)，按 2.1.1 项下色谱条件分别进样 1，3，5，7，9，11 μL，测定峰面积，以峰面积(Y)为纵坐标、进样量（X，μg）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y＝4 310.9 X＋20.326， r＝1.000 0(n＝6)，进样量线性范围为 0.099 7 ～ 1.096 7 μg。

精密度试验：精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液5 μL，连续进样 6 次。结果的 RSD 为 0.70%(n ＝6)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：精密吸取正交试验7号样品溶液10 mL，制备供试品溶液，按照 2.1.1项下色谱条件，分别于 0，2，4，6，12，24 h 时进样 5 μL。结果盐酸小檗碱峰面积的 RSD为0.65%(n＝6)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：精密吸取正交6号样品溶液，平行制备6份供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件，进样测定。结果盐酸小檗碱含量均值为 97.72 μg／mL， RSD 为1.69%(n＝6)，表明方法重复性较好。

加样回收试验：精密吸取已知含量的样品溶液（盐酸小檗碱含量为 0.135 g／L）2 mL，共 9 份，置 10 mL 棕色瓶中，分别精密加入低、中、高质量浓度的盐酸小檗碱对照品溶液（0.56 g ／mL）0.4，0.5，0.6 mL 各 3 份，制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件进样测定。结果盐酸小檗碱的平均加样回收率分别为98.00%，97.00%和99.00% ，RSD 分别为 0.82%，0.63% 和 1.22%(n ＝9)，表明方法的回收较好。

图1 妇科灌肠液高效液相色谱图

2.2 水提工艺条件优选

2.2.1 正交试验设计

根据煎煮法的条件选择加水量（因素A）、提取时间（因素B）及提取次数（因素C）3个条件为考察因素，各因素根据实际情况均取3个水平，以提取物盐酸小檗碱含量和干浸膏得率为评价指标，用 L9（34）安排试验，因素水平表见表1。

表1 水提工艺条件优选因素水平表

2.2.2 浸膏得率测定

分别精密吸取9组正交样品溶液1 mL，分别置卤素水分测定仪，按已设定测量条件（温度程序：阶梯；干燥温度：0～4 min，升至 200℃，4 min后降至 105℃；关闭模式：60 min；测量时间：5 min），测出含水量，计算浸膏得率。

表2 正交试验设计及结果(n＝9)

2.2.3 结果与分析

根据正交试验设计，计算盐酸小檗碱含量和浸膏得率，进行多指标综合加权评分，结果见表2。为进一步确定各因素对结果的影响大小，对试验结果进行方差分析，结果见表3。由极值和方差分析表可以得出，影响妇科灌肠液提取的工艺因素的强度依次为C（提取次数）＞A（加水倍数）＞B（煎煮时间），且提取次数为显著性影响因素（P＜0.05），因素A和因素B对试验结果无显著性影响。因此确定各因素的最佳水平组合为A2B2C3，即煎煮3次，每次加10倍量水，每次1 h。

表3 方差分析表

2.2.4 工艺验证试验

分别称取5倍量的处方药材，共3份，按优选的提取工艺A2B2C3进行验证试验。结果见表4，其 RSD为1.6%，表明优选出的工艺条件稳定，合理可行。

表4 提取工艺验证试验结果(n＝3)

3 讨论

正交试验的极差分析结果显示，提取次数对试验有显著性影响，故就提取次数进行追加，结果显示与最佳提取工艺（A2B2C3）无显著性差异，再从生产的综合效益出发，考虑到节能降耗、缩短生产周期等因素，最终确定各因素的最佳水平组合为A2B2C3。

本研究中创新地通过采用卤素水分测定浸膏得率，测定提取液水分含量，间接得出浸膏得率，且只需耗时约6 min，比传统的烘箱烘至恒重法大大节省了时间及能源，提高了试验效率，且试验准确度更高[13]。

本试验中考察了乙腈－0.1%磷酸水溶液、乙腈－0.2%磷酸水溶液和乙腈－0.2%磷酸水溶液－磷酸二氢钾等流动相系统对盐酸小檗碱成分分离的影响，发现采用乙腈－0.2%磷酸水溶液流动相系统，梯度洗脱，且不用加缓冲盐（磷酸二氢钾、十二烷基磺酸钠等），也能较好地将盐酸小檗碱色谱峰与其他色谱峰分离，理论板数以盐酸小檗碱计算不低于50 000。

由于盐酸小檗碱是该处方中君药黄柏的主要有效成分，其含量的高低经配伍后对临床疗效影响较大，因此选择盐酸小檗碱的含量作为评价指标之一，权重系数较高，以0.7为宜。浸膏得率作为提取工艺的参考指标，能部分反映出该处方药物的提取质量，但浸膏得率与疗效不成正比例关系，故综合评价时权重系数相应较小，以 0.3为宜[14]。

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Optimization of Extraction Process for Gynecological Enema Liquid by Halogen Moisture Determination and HPLC

Liu Fengle1， Qiu Xun1， Gao Wenquan1， Wang Ruirui1， Zhao Guifen1， Yang Lei2， Zhao Aimei1
（ 1.Dali Hospital of Traditional Chinese Medicine， Dali， Yunnan， China 671000； 2.Dali First People′s Hospital， Dali， Yunnan， China 671000）

Objective To optimize the extraction process for gynecological enema liquid.Methods Halogen moisture determination and HPLC were adopted，with the extracting rate and content of berberine hydrochloride as indexes，water volume （A），extracting time （B）and extracting times （C） as factors，the optimum extraction process was optimized by orthogonal test.Results The optimum process was determined as adding 10 times of water and extracting 1 h for 3 times.Conclusion This method can be used as the extraction process for gynecological enema liquid.

gynecological enema liquid；orthogonal test；extraction process；berberine hydrochloride；extracting rate

TQ460.6；R284.2

A

1006－4931(2017)20－0017－04

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.20.005

刘凤乐，男，硕士研究生，主管中药师，研究方向为医院制剂研发及质量管理，（电话）0872－2196090（电子信箱）lflcpu＠ 163.com。

赵爱梅，女，副主任中药师，研究方向为中药质量控制，（电话）0872－2196090（电子信箱）651884308＠qq.com。

2017－06－06)