肿瘤抑素相关肽T42对人脐静脉内皮细胞和人胃腺癌细胞的抑制作用

郑州大学附属洛阳中心医院（471000）董瑞强 张丹凤 孙广荣

肿瘤抑素所处的位置为IV型胶原α3链的C端非胶原区，其可以会导致机体出现肺出血，以及肾小球肾炎。因此不能将其对人体进行直接应用[1]。本次研究的时间段为2016年1月～2016年6月，探讨肿瘤抑素相关肽T42对人脐静脉内皮细胞和人胃腺癌细胞的抑制作用，现报告如下。

1 材料和方法

1.1 研究材料 本次研究所选用的观察对象为细胞，分组的方式为随机分组，开展的时间段为2016年1月～2016年6月，本次研究所采用的大肠杆菌来自SMELD公司，本次研究所采用的人脐静脉内皮细胞是由我院样本室自主保存，本次研究所采用的人胃腺癌中分化细胞株来自广州生物研究所，本次研究所采用的T42表达载体的构建工作是由本次研究人员共同来完成。

1.2 研究方法 肿瘤抑素相关肽T42的表达与纯化：于大肠杆菌菌株中，将T42质粒转化进来，将单菌落进行挑选，将其置于LB培养基接种，培养基中含有氨苄青霉素，浓度为100mg/L，对培养基进行震荡，保持温度为37℃，第2d按照1∶50的比例，再次于LB培养基上接种，培养基含有氨苄青霉素，开始震荡30min，保持温度为37℃，将IPTG加入，浓度为0.5mmol/L。继续进行培养，时间6h，保持温度为28℃，之后开展离心，时间10min，速度为每分钟5000转，离心完成后，对菌体进行收集。于预冷的裂解缓冲液中将菌体重悬，超声破菌后，离心，时间15min，速度每分钟12000转，提取上清液，注入几丁质亲和柱。

细胞增殖抑制实验的方法选用MTT法进行，对人脐静脉内皮细胞，以及人SGC-7901胃腺癌细胞进行培养基培养，使其发展为对数期，采用胰酶进行消化，开展接种，使其位于96孔板，保持温度为37℃，培养24h后，分6组，分别加T21肽，T19肽，T42肽，T19+T21肽，以及顺铂，上述物质分别加不同浓度，对照组加磷酸盐缓冲液，加液量同上述剂量相同，各浓度共包括6个复孔，终浓度为200，100，50，30，以及10mg/L。24h后，将MTT取20μL加入各孔中，孵育时间为4h，将孔内培养液吸取干净，之后在采用二甲基亚砜进行添加，添加量为100μL，开始振荡，时间为10min，对吸光度进行测定。

苏木精-伊红染色观察细胞形态：取人脐静脉内皮细胞，以及人SGC-7901胃腺癌细胞，两种细胞的生长期应为对数生长期，接种于24板孔，24h后，将终浓度为40mg/L的T42肽加入各孔，对照组加入磷酸盐缓冲液，24h后，将盖玻片取出，进行处理，包括固定，漂洗，苏木精-伊红染色等，然后借助显微镜进行观察。

细胞迁移抑制实验：取人脐静脉内皮细胞，以及人SGC-7901胃腺癌细胞，两种细胞的生长期应为对数生长期，接种于24板孔，直至其生长覆盖率超90%后，于孔板底部，采用移液器枪头进行划痕，形成无细胞区，宽度约4mm，反复采用磷酸缓冲液进行冲洗，之后采用新鲜培养基进行重新加入，各细胞分3组，T42肽组，T19+T21肽半量联合组，以及对照组，各组设复孔3个，于24h后，48h后观察其迁移能力。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析。用±s来表示计量数据，行t检验；用[例数(%)]来表示计数资料，行X2检验；P＜0.05表示有统计学意义。

2 结果

2.1 T42肽对人脐静脉内皮细胞和人SGC-7901胃腺癌细胞生长的影响 T42肽不仅会抑制人脐静脉内皮细胞，同时也会抑制人SGC-7901胃腺癌细胞，同时这种抑制作用于剂量存在明显的关系，前者的IC50为45mg/L，后者的IC50为51mg/L。如附表1、2所示。

附表1 人脐静脉内皮细胞存活率（%）

附表2 人SGC-7901胃腺癌细胞存活率（%）

附表3 T42肽对两种细胞迁移的抑制作用

2.2 T42肽对两种细胞形态的影响 T42肽在产生作用达到24h之后，可以发现人脐静脉内皮细胞和人胃腺癌细胞出现细胞凋亡现象，同时上述两种细胞同周围的细胞发生分离，出现了皱缩，细胞的形状呈现为卵圆形或圆形。

2.3 T42肽对两种细胞迁移的抑制作用 采用T42肽作用于两种细胞，使其发挥作用达到24h或是达到48h，结果都会对人脐静脉内皮细胞和人胃腺癌细胞的迁移产生明显的抑制作用。同时这种抑制作用同40mg/L的T19+T21肽半量联合使用差异并不明显（P＞0.05）。如附表3。

3 讨论

肿瘤抑素在对肿瘤细胞进行杀灭时，不会对人体的正常细胞造成破坏，因此其不具有毒副作用。肿瘤抑素的功能区包括两个，因此也就赋予了其具有的双重抗肿瘤作用[2]。具有更为强烈的肿瘤抑制作用。加之该类物质具有较高活性的抗血管作用，达到内皮抑素的10倍，因此在采用其对机体进行治疗时，不需要大量用药，小剂量即可。相应的将治疗成本有效降低，更有利于临床应用普及[3]。

肿瘤抑素发挥其具有的抗血管作用，主要是凭借其对内皮细胞增殖，管状化，以及细胞蛋白合成起到抑制作用，本次研究所采用的原核载体，有效地表达了目的基因，表达出的融合蛋白，其在上清液中，占到菌体蛋白的含量超过40%，加之采用几丁质亲和层析柱，开展纯化，因此结果更为可靠有效。本次研究结果显示，T42肽不仅会抑制人脐静脉内皮细胞，同时也会抑制人SGC-7901胃腺癌细胞，同时这种抑制作用与剂量存在明显的关系，前者的IC50为45mg/L，后者的IC50为51mg/L。T42肽在产生作用达到24h之后，可以发现人脐静脉内皮细胞和人胃腺癌细胞出现细胞凋亡现象，同时上述两种细胞同周围的细胞发生分离，出现了皱缩，细胞的形状呈现为卵圆形或圆形。采用T42肽进行使用，使其发挥作用达到24h或是达到48h，都会对人脐静脉内皮细胞和人胃腺癌细胞的迁移产生明显的抑制作用。同时这种抑制作用同40mg/L的T19+T21肽半量联合使用差异并不明显（P ＞0.05）。证实了T42肽可对人脐静脉内皮细胞和人SGC-7901胃腺癌细胞的生长和迁移起到抑制作用，对肿瘤细胞和内皮增殖发挥抑制作用，从而可能对血管生长具有抑制作用。