非线性动力学分析在重复经颅磁刺激对阿尔茨海默病大鼠学习记忆能力改善方面的应用*

崔桂雪，闫海亮，张红星，于毅△

（1.涿州市医院，河北 涿州072750；2.新乡医学院，河南 新乡453003）

1 引 言

随着中国人口老龄化日益严重，老年痴呆患者人数不断上升。老年痴呆又称阿尔茨海默病（alzheimer disease，AD），AD患者的主要症状是进行性认知功能障碍和记忆损害［1-2］。目前关于AD的药物治疗效果并不理想，虽然已有基因和免疫疗法［3-5］，但其尚处于试验阶段，因此一些学者将目光投向特异性好、经济成本低的物理疗法，即重复经颅磁刺激（repetitive transcranial magnetic stimulation，rTMS）［6-7］。脑电图（EEG）通过头皮电极记录大脑神经细胞的电生理活动，利用工程学手段对EEG信号进行分析，可以得出一些客观的病理诊断信息［8］。传统的脑电处理方法有着自身的缺陷，近年来出现了脑电信号的非线性动力学分析，能更好的反应脑电信号的本质［9］。LZ复杂度作为非线性动力学常用指标之一，具有突出的优点，其算法简单、抗干扰和抗噪声能力强，对随机、确定以及混沌信号均可以使用，只需要使用较少的数据就可以得到较稳定的结果［10］。

2 研究对象

同批次健康成年雄性（sprague-dawley，SD）大鼠100只饲养于温度22±2℃，湿度55%～56%，光照条件维持昼夜节律12 h明暗交替，给予大鼠自由饮水及摄食，进入实验时体重约为220～250 g。

3 实验方法

3.1 AD模型制备

大鼠双侧海马注射经36 h孵育的Aβ1-42制备AD大鼠模型。参考Paxinos＆Watson的方法选取大鼠双侧海马，于前囟向后3.2 mm，中线旁开2.5 mm处。术中注意无菌操作，以降低动物死亡率。7 d后进行Morrs水迷宫实验验证模型。

3.2 rTMS干预方法

造模结束14 d后进行rTMS干预，rTMS“8”字形线圈置于（rTMS＋AD）组大鼠头部上方，线圈平面与大鼠头皮紧贴平行；AD组和正常组进行伪刺激，将线圈翻转向上，使其接受无脉冲作用于头部的伪刺激。治疗安排：将（rTMS＋AD）组、AD组和正常组放置于相同的环境，连续14 d，每天上午进行rTMS和伪刺激，各项刺激参数见表1。

表1 r TMS刺激参数Table 1 r TMS stimulation parameters

3.3 行为学指标观察

磁刺激干预结束后，三组大鼠每组随机挑选8只进行Morris水迷宫实验以检测各组大鼠空间学习记忆能力的差异，包括定位航行实验和空间探索实验，前者用于测试大鼠的学习能力，后者用于测试大鼠的记忆能力。

3.4 脑电指标测量

3.4.1 电极制作与固定 脑电采集电极所用材料（见图1a），具体制作步骤：（1）将 PCB板与20针Samtec接口焊接到一起。（2）将8根铜丝一端拧上专用小螺丝钉，另一端焊接到PCB板上。（3）使用万用表检测各个通道的导通性。（4）铺胶封装电极。

图1 a.制作电极所用材料；b.脑电采集Fig 1a.Electrode material；b.EEG acquisition

电极固定：（1）将称重之后的大鼠使用10%水合氯醛（10 g/100 mL）进行麻醉。（2）固定大鼠于立体定位仪上，内耳连线比上门齿水平高0.5 mm，剪去其头部皮毛，除去颅骨软组织，暴露出颅骨，使其前后囟清晰可见。（3）使用立体定位仪上的千分尺确定电极坐标，即额叶定位坐标：前囟后1.5 mm，中线旁2.0 mm；颞叶定位坐标：前囟后3.0 mm，中线旁3.5 mm；顶叶定位坐标：前囟后3.5 mm，中线旁1.0 mm；枕叶定位坐标：前囟后5.0 mm，中线旁3.2 mm。所有电极下降深度为0.5 mm，参考电极置于嗅球上方，接地电极置于人字缝后方3.0 mm，中线旁0 mm处。（4）将电极制作步骤中的8个螺丝固定于做标记处，使用牙科水泥封合暴露的颅骨。

3.4.2 脑电采集 待大鼠麻醉清醒后，利用Cerebus 64通道神经电生理信号记录系统连续一周采集大鼠脑电（见图1b），采样频率为1 KHz，陷波器为50 min，每只大鼠每次记录8 min（分4次，每次2 min）。

3.5 脑电信号处理与统计分析

用3sigma方法剔除具有明显较大误差的数据组，各个通道脑电经0～30 Hz带通滤波之后，利用AR模型功率谱估计算法计算各个通道δ（1～3 Hz）、θ（4～7 Hz）、α（8～13 Hz）和 β（14～30 Hz）频带内的能量，求取每组大鼠每次采集脑电各个频带内的平均能量值作为最终的各个频带能量值；使用二值粗粒化方法求每组大鼠各个通道的δ、θ、α和β频带的LZ复杂度，求出每组大鼠每次采集脑电各个频带内的平均LZ复杂度值作为最终各个频带的LZ复杂度值。其中利用3sigma法剔除较大误差数据在Excel中完成，带通滤波、求功率谱和LZ复杂度在MATLAB软件中编程实现，以及使用spss19.0进行独立样本t检验检测各组之间的差异。

4 实验结果

4.1 水迷宫实验结果

AD组较正常组逃避潜伏期延长，距离平台平均距离变大，差异有统计学意义（P＜0.05）；（rTMS＋AD）组较AD组逃避潜伏期缩短，距离平台平均距离变小，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2和表2。

表2 水迷宫实验结果统计分析Table 2 Statistical analysis of the results of water maze experiment

图2 水迷宫实验结果Fig 2 Results of water maze experiment

4.2 脑电波功率谱结果

见图3和表3，AD组脑电中低频成分（delta＋theta）和高频成分（alpha＋beta）的能量比值均较正常组大鼠增大，其中21通道左颞叶、25通道左顶叶、26通道右顶叶以及30通道右额叶的差异有统计学意义，18通道左枕叶和22通道右颞叶的差别无统计学意义（P＜0.05）；（rTMS＋AD）组脑电中低频成分（delta＋theta）和高频成分（alpha＋beta）的能量比值在18通道左枕叶、21通道左颞叶、22通道右颞叶以及30通道右额叶较AD组减小，在25通道左顶叶和26通道右顶叶较AD组增大，其中只有21通道左颞叶差异有统计学意义（P＜0.05）。

表3 脑电功率谱统计分析Table 3 Statistical analysis of EEG power spectrum

图3 大鼠功率谱对比分析图Fig 3 Comparison Analysis of power spectrum

4.3 脑电波非线性动力学分析-LZ复杂度分析

见图4和表4，AD组各通道脑电LZ复杂度较正常组降低，且左颞叶、左顶叶、右额叶、右颞叶、右顶叶和左枕叶的降低幅度依次为52.31%、45.16%、29.23%、23.94%、19.67%和 11.86%，差异均有统计学意义（P＜0.05）；（rTMS＋AD）组各通道脑电LZ复杂度较AD组升高，且左颞叶、右额叶、右顶叶、左顶叶、右颞叶和左枕叶的升高幅度依次为64.52%、41.30%、36.73%、29.41%、27.78%和21.15%，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表4 大鼠脑电LZ复杂度的统计分析Table 4 Statistical analysis of EEG LZ complexity

图4 大鼠脑电LZ复杂度对比分析图Fig 4 Comparison of EEG LZ complexity

5 讨论

通过对比三组大鼠的脑电信号功率谱结果可得，AD组大鼠脑电中低频成分较正常组增高，与国内外相关文献中研究结果相同。（rTMS＋AD）组大鼠左枕叶、左颞叶、右颞叶以及额叶脑电中低频成分较AD组减低，而左顶叶和右顶叶脑电中低频成分较AD组增高。文献中表明乙酰胆碱和基底前脑维持着脑电的非同步性，由此引发的功能障碍不能抑制皮质慢振荡引发的慢节律，导致快波成分减少和慢波成分的增加［12］。

LZ复杂度表征一个时间序列里出现新模式的速率，复杂度值越高，也说明动力行为学越复杂，脑电信号中含有的信息量越多［13］。本研究中AD组各个通道脑电信号LZ复杂度较正常组降低（见图4），减小幅度为12.4% ～52.2%，说明AD组脑电复杂度呈弥漫性减低，各个通道减小幅度不一，且与记忆相关的左颞叶减低幅度最大。AD组脑电复杂度降低说明AD大鼠脑电中包涵的信息量减少，其对周围环境的变化做出的反应变得简单。大鼠水迷宫实验显示AD组大鼠逃避潜伏期较正常组延长，距离平台距离较正常组增加，说明AD组大鼠学习记忆能力减低。水迷宫实验结果与LZ复杂度结果符合。

（rTMS＋AD）组大鼠各个通道脑电信号的LZ复杂度较AD组均有上升，上升幅度从9.4%～63.2%。其中左颞叶上升幅度最大63.2%，（rTMS＋AD）组大鼠脑电中复杂度的上升说明rTMS使AD大鼠对周围事物的反应变得复杂，其脑电信号中包涵的信息量就增加。目前，rTMS对刺激大脑皮质的作用机制还不完全清楚，但主要研究结果均提示rTMS有改变大脑皮质兴奋性，提高大脑皮质神经元细胞可塑性和连接性，改变靶位皮质血流和代谢的作用［14-15］。大鼠水迷宫实验结果显示（rTMS＋AD）组较AD组逃避潜伏期缩短，距离平台距离减小，说明经过rTMS之后的AD大鼠学习记忆能力提高［16-17］。

由以上可知，rTMS可以改善AD大鼠学习记忆能力，经磁刺激之后的AD大鼠各通道脑电信号LZ复杂度统一增加，功率谱变化4个通道低频成分较AD组增加，2个通道低频成分较AD组减低，变化结果不统一；AD组各通道脑电复杂度较正常组降低，且功率谱中低频成分较正常组增多，复杂度和功率谱变化均比较统一。因此，LZ复杂度更适合用于诊断AD以及评价rTMS对AD大鼠学习记忆能力的改善作用。与临床上常用的神经心理学量表相比，LZ复杂度更加客观、准确，值得在临床上推广使用。