响应面法优化铜绿假单胞菌产鼠李糖脂发酵培养基的研究

巩志金，刘胜格，梁鑫鑫，魏贝贝，梁光杰，杨 革，刘金锋，车程川*

（曲阜师范大学 生命科学学院，山东 曲阜 273100）

响应面法优化铜绿假单胞菌产鼠李糖脂发酵培养基的研究

巩志金，刘胜格，梁鑫鑫，魏贝贝，梁光杰，杨 革，刘金锋，车程川*

（曲阜师范大学 生命科学学院，山东 曲阜 273100）

该研究对铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）SKY01产鼠李糖脂的发酵培养基组分进行了优化。采用单因素试验确定豆油、硝酸钠及微量元素的添加量。在单因素试验的基础上，采用响应面试验设计进行培养基组分优化。结果表明，最佳发酵培养基配方为豆油80 g/L、硝酸钠4 g/L、微量元素8.5‰。在此最佳培养基组分条件下，鼠李糖脂的产量达到45.34 g/L，比优化前的产量39.62 g/L提高了14.43%。

铜绿假单胞菌；鼠李糖脂；响应面法；培养基组分优化

鼠李糖脂（rhamnolipid）主要是由微生物次级代谢产生的一种阴离子生物表面活性剂（biosurfactants），其亲水基团一般由1～2分子的鼠李糖环构成，疏水基团由不同碳链长度的脂肪酸构成[1]。与传统化学合成的表面活性剂相比，鼠李糖脂生物表面活性剂具有无毒、可再生、易生物降解等优良性能，具有十分广阔的应用前景[2]。如在石油化工领域，鼠李糖脂可参与形成新的驱油复配体系，提高原油的采收率。乐建君等[3]用鼠李糖脂复配体系在大庆油田进行生物表面活性剂驱油技术实验，发现鼠李糖脂复配驱油体系采收率比水驱体系提高7.9%～9.3%，投入产出比高达1∶2.4。在生物医药领域，鼠李糖脂是一种可用于处理皮肤灼伤及部分皮肤病的潜在药物。TAMARA S等[4]已经比较全面的阐述了鼠李糖脂在治疗皮肤烧伤的作用，并取得了宝贵的临床应用经验。另外在食品工业领域，鼠李糖脂可作为增大烘焙体积的膨大剂和水果保鲜剂，其食用安全性已通过了美国环保署（environmentalprotectionagency，EPA）的食用安全认证。

目前，鼠李糖脂主要通过铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）液态发酵产生。发酵过程易受培养基组分变化的影响，特别是受用于维持菌体生长和产物生成所必需的碳源、氮源等的影响尤为突出。经过几十年的研究，人们已经发现疏水性的植物油和可被快速利用的硝酸钠是铜绿假单胞菌产鼠李糖脂的最佳碳源和氮源，并且通过合理的控制培养基中硝酸钠的含量可有效的提高发酵产量[5-6]。如GIANI C等[7]以豆油为碳源、硝酸钠为氮源，采用氮源限制的分批发酵方式生产鼠李糖脂，产量达到了112 g/L。另外除碳源和氮源外，微量元素也一类影响鼠李糖脂发酵的重要物质。GUERRA-SANTOS L等[8]研究发现，铁离子在微量元素中对铜绿假单胞菌发酵产鼠李糖脂的影响最大并进一步通过优化培养基中碳与铁的比例，获得了最高鼠李糖脂产量。响应面分析法则是一种常用的发酵培养基优化方法，主要原理是利用合理的试验组合设计，采用多元二次回归方程拟合各影响因素与响应值之间的函数关系，并通过对回归方程的分析确定最佳工艺参数[9-11]。利用响应面分析法进行发酵培养基的优化，既可以有效地减少试验次数，缩短试验时间，避免盲目性，又能得到合理有效的试验结果[12-13]。

本研究在单因素试验[14-15]的基础上，根据响应面分析法中Box-Benhnken Desgin（BBD）试验设计原理[16-17]，利用Design-Expert 8.0.6软件对鼠李糖脂发酵培养基进行组分优化，以期得到培养基组分的最优配比提高鼠李糖脂的产量，并为鼠李糖脂发酵培养基的优化提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）SKY01：由本实验室保藏。

1.1.2 主要试剂

苔黑酚、硝酸钠、七水硫酸铁、七水硫酸镁、七水硫酸锌、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、五水硫酸铜、一水硫酸锰、四水氯化钙、L-鼠李糖一水合物（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白酶蛋白胨、酵母提取物（均为生化试剂）：英国Oxoid公司。

1.1.3 微量元素溶液及培养基

微量元素溶液：ZnSO4·7H2O0.29g/L，CaCl2·4H2O0.24g/L，CuSO4·5H2O 0.25 g/L，MnSO4·H2O 0.17 g/L，FeSO4·7H2O 0.000 28 g/L，0.22 μm滤膜过滤除菌。

种子培养基：葡萄糖10 g/L，胰蛋白胨5 g/L，酵母提取物1 g/L，氯化钠0.5 g/L，115℃条件下灭菌20 min。

发酵培养基：KCl1.1g/L，NaCl1.1g/L，KH2PO43.4g/L，K2HPO44.4 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaNO37 g/L，豆油70 g/L，酵母提取物0.5 g/L，并加入5‰的微量元素溶液，121℃条件下灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

TU-19紫外可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；SIGMA 2-16PK通用型离心机：德国Sigma公司；SW-CJ-1D超净工作台：苏州净化设备有限公司；HH-4D恒温水浴锅恒康仪器设备有限公司；TS-1102立式摇床：上海天呈试验仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种培养

种子活化：将铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）SKY01在无菌条件下用灭菌竹签挑取少许，在固体种子培养基上划线，30℃培养至出现单菌落。挑取单菌落接种至装液量为3 mL/15 mL的试管中，30℃、200 r/min培养8 h。

种子培养：将活化好的种子按10%的接种量转接至摇瓶种子培养基中，30℃、200 r/min培养8 h，准备接种。

1.3.2 鼠李糖脂的发酵

发酵培养：按10%接种量将种子液转接到装液量为25 mL/250 mL摇瓶中，30℃、200 r/min振荡培养144 h。

1.3.3 培养基组分优化

单因素试验：设计单因素试验考察发酵培养基中不同浓度的豆油、硝酸钠及微量元素对鼠李糖脂产量的影响，确定各因素的中心值及水平。

响应面试验：利用响应面分析法中Box-BehnkenDesign（BBD）试验设计原理，采用单因素试验确定的中心值（用“0”表示）、低水平（用“-1”表示）和高水平（用“+1”表示），以鼠李糖脂的产量（Y）为响应值，对发酵培养基中豆油（A）、硝酸钠（B）及微量元素（C）含量进行优化，得到最佳发酵培养基配方，试验因素与水平见表1。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels of response surfer experiments

1.3.4 鼠李糖脂检测

称取0.19 g苔黑酚，加入100 mL 53%的硫酸溶液溶解，待冷却后避光保存备用。配制质量浓度为0、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L的L-鼠李糖一水合物溶液，按照苔黑酚-浓硫酸比色法制得鼠李糖标准曲线[18]。

将发酵液（萃取剂为氯仿∶乙醇=2∶1）萃取、吹干后加入蒸馏水稀释至相应浓度。取0.3 mL上述稀释液于具塞比色管中，加入2.7 mL苔黑酚-浓硫酸溶液，混匀，于80℃恒温水浴反应30 min。反应结束后冷却至室温，在421 nm波长处测定吸光度值，并根据鼠李糖标准曲线回归方程计算得到鼠李糖的含量，然后乘以鼠李糖脂与鼠李糖的质量比例系数3.4，计算鼠李糖脂的含量[19]。

2 结果与分析

2.1 鼠李糖标准曲线的制作

在酸性条件下鼠李糖脂中的2'-脱氧胸苷-5'-二磷酸-L-鼠李糖（deoxy-thymidine-diphospho-L-rhamnose，dTDP-L-rhamnose）与β-羟基烷酸（β-hydroxyalkanoate，β-HAA）之间的糖苷键会发生水解，生成鼠李糖和相应的羟基烷酸，通过测定鼠李糖的含量，计算得到鼠李糖脂的含量[20]。以鼠李糖质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制鼠李糖标准曲线，结果见图1。

由图1可知，标准曲线的线性回归方程为y=0.020 5x+0.016，相关系数为R2=0.997，说明二者线性关系良好，可用于鼠李糖脂的检测。

2.2 接种时间的确定

选择适当种龄的菌种接种十分重要，通常选择生长旺盛的对数期末期的种子进行接种。由图2可知，0～2 h为菌株生长的迟缓期，菌株逐渐适应培养环境并缓慢生长。2～10 h为菌株的对数生长期，菌体开始快速生长，并在8～10 h的对数期末期逐渐达到峰值。此时，比生长速率开始明显下降。10～14 h为菌株生长的稳定期，此时菌体浓度已达到最大并保持不变。14～18 h时菌株开始大量死亡，菌体浓度逐渐下降，菌株进入衰亡期。因此，本实验选择培养时间为8 h种子进行接种为宜。

图2 铜绿假单胞菌SKY01的生长曲线Fig.2 Growth curve ofP.aeruginosaSKY01

2.3 单因素试验结果

分别对发酵培养基中影响鼠李糖脂发酵的豆油、硝酸钠及微量元素添加量进行单因素试验设计，结果如图3所示。

图3 豆油(a)、硝酸钠(b)及微量元素(c)添加量对鼠李糖脂产量的影响Fig.3 Effects of soybean oil(a),NaNO3(b)and trace elements(c)additions on rhamnolipid yield

由图3a可知，随着豆油添加量的增加，鼠李糖脂产量呈现先升后降的趋势，当豆油添加量为80 g/L时，鼠李糖脂达到最优产量42.38 g/L，故将80 g/L作为响应面设计中豆油含量的中心点，中心点左、右两侧等距离的因变量70 g/L和90 g/L作为低水平和高水平。由图3b可知，硝酸钠添加量的中心点为4 g/L，低水平和高水平分别为3 g/L和5 g/L；由图3c可知，微量元素添加量的中心点为8‰，低水平和高水平分别为6‰和10‰。

2.4 Box-Behnken Design试验结果

根据单因素确定的中心点和因素水平，运用Design Expert 8.0.5b中BBD试验设计原理进行3因素3水平的响应面试验设计，试验设计方案和结果如表2所示。对表2中进行多元回归拟合，建立二阶回归模型，找到最优响应因子水平，多元二次回归方程如下所示：

表2 Box-Behnken试验设计及结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

由模型的回归结果分析（表2）和方程方差分析（表3）可知，该二次模型显著（P=0.000 9＜0.05），失拟项不显著（P=0.189 0＞0.05），决定系数R2=0.949 8，说明有94.98%的变差能够由该模型解释；变异系数（coefficient of variation，CV）为2.39%，说明变异（偏离）程度较小。由图4可知，两两因素间有一定的交互作用，最佳预测点在试验考查范围内。因此，该二阶归模型具有良好的拟合度，能真实地描述各因素与响应值之间的关系，可对Pseudomonas aeruginosa SKY01发酵产鼠李糖脂进行预测和分析。

由回归方程预测得到各组分含量为豆油78.5 g/L，硝酸钠3.87 g/L，微量元素8.5‰，预测鼠李糖脂产量为45.070 3 g/L。为方便实际培养基配制，选取豆油80 g/L，硝酸钠4 g/L，微量元素8.5‰。因此，通过响应面优化后得到的最佳发酵培养基配方为KCl 1.1 g/L，NaCl 1.1 g/L，FeSO4·7H2O 0.000 28 g/L，KH2PO43.4 g/L，K2HPO44.4 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaNO34 g/L，80 g/L豆油，0.5 g/L酵母提取物，并加入8.5‰微量元素溶液。

表3 响应面试验回归模型方差分析Table 3 Variance analysis on of response surface experiments regression mode

图4 硝酸钠、豆油和微量元素添加量交互作用对鼠李糖脂产量影响的响应面及等高线Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between NaNO3,soybean oil and trace elements addition on rhamnolipid yield

2.5 模型验证及分析

图5 培养基优化前后鼠李糖脂的产量变化Fig.5 Changes of rhamnolipid yield of before and after culture medium optimization

为检验模型可靠性和有效性，分别用模型预测的最优培养基配方和原始培养基配方进行摇瓶发酵，每组实验设置3个平行，检测不同取样时间时的发酵产量，结果如图5所示。由图5可知，鼠李糖脂最高产量为45.34 g/L，比未优化前的产量39.62 g/L提高14.43%，优于大部分已报道的摇瓶发酵结果[21-22]。与初始发酵条件相比，豆油与硝酸钠的质量比值由10∶1增加至20∶1，这与控制氮源浓度可提高铜绿假单胞菌发酵产量的报道相一致[5]；微量元素的浓度增加了近1倍，说明初始培养基中微量元素浓度偏低，从而影响发酵。模型的预测值与实际发酵结果十分接近说明模型能较好的反映豆油、硝酸钠和微量元素添加量对鼠李糖脂发酵的影响，预测性良好。

3 结论

本试验首先通过单因素试验确定了豆油、硝酸钠及微量元素的中心点和水平范围。进一步在单因素试验的基础上采用响应面分析法中BBD试验设计方法进行培养基组分优化，得到培养基中相应组分的最佳含量为豆油80 g/L、硝酸钠4 g/L和微量元素8.5‰。在最佳浓度条件下通过发酵得到鼠李糖脂的产量为45.34 g/L，优于大部分已报道的摇瓶发酵结果，达到优化目的。另外本试验也获得了一个能较好反映豆油、硝酸钠和微量元素对鼠李糖脂发酵影响的模型，为鼠李糖脂发酵培养基的优化提供了技术参考。

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Optimization of fermentation medium components for rhamnolipid production by

Pseudomonas aeruginosawith response surface methodology
GONG Zhijin,LIU Shengge,LIANG Xinxin,WEI Beibei,LIANG Guangjie,YANG Ge,LIU Jinfeng,CHE Chengchuan*(College of Life Science,Qufu Normal University,Qufu 273100,China)

The fermentation medium components for rhamnolipid production byPseudomonas aeruginosaSKY01 were optimized in this paper.The additionsofsoybean oil,NaNO3and trace elementswere investigated bysingle factor experiments.Based on single factor experiments,response surface methodology were applied to optimize medium components.Results showed that the optimum fermentation medium formula were soybean oil 80 g/L,NaNO34 g/L and trace elements 8.5‰.Under these conditions,rhamnolipid yield was up to 45.34 g/L,which was 14.43%higher than that of before optimization(39.62 g/L).

Pseudomonas aeruginosa;rhamnolipid;response surface methodology;medium components optimization

TQ920.6

0254-5071（2017）09-0127-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.028

2017-05-12

国家级“本科教学工程”专业综合改革试点项目（ZG0293）；高校应用型人才培养专业发展支持计划（鲁教高字[2015]5号）；曲阜师范大学科技计划（xkj201610）

巩志金（1988-），男，助理实验师，硕士，研究方向为代谢与发酵工程。

*通讯作者：车程川（1978-），男，讲师，硕士，研究方向为发酵工程。