静态顶空-气质联用法检测葡萄酒中香气成分条件的优化

祁新春，张会宁*，卫磊鹏，白春艳

（山西戎子酒庄有限公司，山西 乡宁 042100）

静态顶空-气质联用法检测葡萄酒中香气成分条件的优化

祁新春，张会宁*，卫磊鹏，白春艳

（山西戎子酒庄有限公司，山西 乡宁 042100）

采用静态顶空（SHS）与气-质联用技术（GC-MS）测定葡萄酒中挥发性香气成分。通过单因素试验分别考察平衡温度、平衡时间、样品量和NaCl添加量对干红葡萄酒香气成分有效峰个数的影响。以有效峰个数（匹配度＞85%）为评价指标，采用正交试验优化了香气成分的检测条件。结果表明，静态顶空-气质联用检测干红葡萄酒中香气成分的最佳条件为：平衡温度55℃，平衡时间35 min，样品量8 mL，NaCl添加量2.4 g。在此条件下，共鉴定出干红葡萄酒中的香气成分18种，其中醇类8种、酯类9种和1种酸。

葡萄酒；香气成分；条件优化；静态顶空-气质联用

葡萄酒是破碎或未破碎的新鲜葡萄果实或葡萄汁经完全或部分酒精发酵后获得的饮料。香气物质是构成葡萄与葡萄酒质量的主要因素之一，其主要来源有葡萄品种本身、生化反应、微生物代谢、葡萄酒贮存期间的化学或酶反应等[1-3]。葡萄酒中所含香气成分的种类、含量、感官阈值是评判葡萄酒品质的重要指标，决定了葡萄酒的风味和典型性[4-5]。

目前，色谱技术已广泛用于葡萄酒香气成分的分析，顶空萃取可以准确并精确地进行多个样品的自动分析，使用顶空进样可以非常有效地减少用于样品前处理的时间和金钱，无需从基体中提取出被分析物以便进行液体进样。常见的的顶空类型包括：静态顶空（static headspace，SHS）、动态顶空或称吹扫捕集（dynamic headspace，DHS）、固相微萃取技术（solidphase microextraction，SPME）。常用的气相色谱定量方法主要有4种，即面积归一化法、外标法、内标法和标准加入法[6-7]。

本研究采用静态顶空结合气相色谱-质谱法（static headspacegaschromatography-massspectrometry，SHS/GC-MS）检测干红葡萄酒中香气成分，使用峰面积归一法进行定量分析，以有效峰个数为评价指标，采用正交试验研究了平衡温度、平衡时间、样品量和NaCl添加量对干红葡萄酒香气成分有效峰个数的影响，优化葡萄酒香气成分检测参数，旨在为干红葡萄酒香气成分的检测方法提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2012年干红葡萄酒酒样：山西戎子酒庄有限公司；NaCl（分析纯）：汕头市西陇化工厂有限公司。

1.2 仪器与设备

GC7890A-MS5975C气相色谱-质谱联用仪、7697A顶空进样器、DB-Wax毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）：美国Agilent公司；明澈TM-D 24UV纯水系统：德国默克密理博公司；KQ3200E超声波清洗器：昆山市超声仪器清洗有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理方法

将准备好的干红葡萄酒酒样8.0 mL与2.4 g NaCl加入20 mL顶空瓶中，压紧瓶盖，密封，待测。

1.3.2 顶空条件[8]

进样环体积1 mL，样品瓶加压压力138 kPa，加压时间0.2 min，充气时间0.2 min，进样时间1 min。顶空平衡温度55℃，顶空平衡时间35 min。

1.3.3 气相色谱-质谱检测条件[9-10]

气相色谱条件：进样口温度250℃；柱温采用程序升温，起始温度50℃，保留5 min，以4℃/min升至160℃，再以10℃/min升至220℃，保留10 min；恒定流速1 mL/min，分流比30∶1，载气：氦气（He）。

质谱条件：连接杆温度280℃，电离方式为电子电离（electronic ionization，EI）源，电子能量70 eV；离子源温度230℃，传输线温度280℃，质谱扫描范围50～550m/z；电子倍增器电压1 141 V；溶剂延迟时间2 min。

1.3.4 定性定量方法[11]

香气成分利用MS全离子扫描模式下的总离子流图谱，依据色谱保留时间、质谱信息和美国国家标准及技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）08标准谱库比对结果相结合的方法进行定性分析；各香气成分的相对含量采用气相色谱峰面积归一法进行定量。

1.3.5 试验设计

单因素试验：根据动力学和热力学原理分析得出，平衡温度、平衡时间、样品量和NaCl添加量是影响静态顶空-气质联用法检测葡萄酒中香气成分有效峰个数的主要因素[3]。因此，分别考察平衡温度（45℃、50℃、55℃、60℃、65℃）、平衡时间（25 min、30 min、35 min、40 min、45 min）、样品量（5 mL、6 mL、7 mL、8 mL、9 mL）和NaCl添加量（1.6 g、2.0 g、2.4g、2.8g、3.2g）对干红葡萄酒香气成分有效峰个数的影响。

正交试验：在单因素试验结果的基础上，本试验将平衡温度（A）、平衡时间（B）、样品量（C）和NaCl添加量（D）作为影响因素，以匹配度＞85%的有效峰个数为评价指标，每个因素选取4个水平，进行4因素4水平的正交设计试验，研究静态顶空/气-质联用检测葡萄酒中香气成分有效峰个数的最佳参数，正交试验因素与水平见表1。

表1 葡萄酒香气成分检测条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for determination conditions optimization of aroma components in wine

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 平衡温度对干红葡萄酒香气成分有效峰个数的影响

考察平衡温度对干红葡萄酒香气成分检测结果的影响，结果见图1。

图1 平衡温度对干红葡萄酒香气成分有效峰个数的影响Fig.1 Effect of equilibrium temperature on the effective peak number of aroma components in dry red wine

由图1可知，随着平衡温度的升高，有效峰个数逐渐增加，当平衡温度达到55℃时，有效峰个数达到最多，为13个；当继续升高平衡温度，可能导致某些香气组分分解，分配系数降低，有效峰个数开始减少[13]。因此，选择55℃作为最佳平衡温度。

2.1.2 平衡时间对干红葡萄酒香气成分有效峰个数的影响

考察平衡时间对干红葡萄酒香气成分检测结果的影响，结果见图2。

图2 平衡时间对干红葡萄酒香气成分有效峰个数的影响Fig.2 Effect of equilibrium time on the effective peak number of aroma components in dry red wine

由图2可知，随着平衡时间的延长，有效峰个数显著增加，当平衡时间达到40min时，有效峰个数达到最多，为14个；当平衡时间持续延长，葡萄酒香气成分的有效峰个数变化不明显，平衡时间既能让组分尽可能多的挥发出来，又可尽量减少溶剂的挥发[14]。因此，选择最佳平衡时间为40min。

2.1.3 样品量对干红葡萄酒香气成分有效峰个数的影响

考察样品量对干红葡萄酒香气成分检测结果的影响，结果见图3。

图3 样品量对干红葡萄酒香气成分有效峰个数的影响Fig.3 Effect of sample volume on the effective peak number of aroma components in dry red wine

由图3可知，随顶空瓶中葡萄酒样品量的增加，香气成分的有效峰个数也增加，当样品量为7 mL时，有效峰个数达到最多，为15个；当样品添加量＜7 mL时，由于样品量对顶空具有一定影响，直接决定气液两相的分配平衡[15]。因此，有效峰个数开始下降。另外，20 mL的样品瓶，样品加入量不能超过瓶高75%。综合考虑，选用7 mL葡萄酒溶液作为顶空瓶的最佳进样量。

2.1.4 NaCl添加量对干红葡萄酒香气成分有效峰个数的影响

考察NaCl添加量对干红葡萄酒香气成分检测结果的影响，结果见图4。

图4 NaCl添加量对干红葡萄酒香气成分有效峰个数的影响Fig.4 Effect of NaCl addition on the effective peak number of aroma components in dry red wine

在液态样品溶剂中，为了提高被分析物的含量，可以将葡萄酒溶液加盐进行饱和[16]。由图4可知，在干红葡萄酒溶液中添加适量的盐，减少了分析物在样品溶剂中的溶解度，降低了分配系数，提高了顶空瓶气相中的浓度和灵敏度；当加盐量为2.4 g时，有效峰个数最多，为15个；随着加盐量的增多会影响酒样的黏性，降低分析物的扩散速度从而影响有效峰个数。因此，选择NaCl的最佳添加量为2.4g。

2.2 正交试验

根据单因素试验结果，以平衡温度、平衡时间、样品量和NaCl添加量作为考察因素，进行正交试验，以有效峰个数作为评价指标，确定静态顶空/气-质联用检测干红葡萄酒中香气成分的最佳条件。正交试验结果与分析见表2，方差分析见表3。

表2 干红葡萄酒香气成分检测条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonalexperiments for determination conditions optimization of aroma components in dry red wine

由表2可知，通过A、B、C、D四个因素中极差R值的大小，可以得出影响有效峰个数的主次顺序是：A＞B=C＞D，即平衡温度为影响最大的因素。

从表2直观地找出最优水平组合为10号，即A3B2C4D3，此时有效峰个数为18个。按照各因素最好水平选取的理论上最优处理组合为A3B2C4D1，在此条件下，检测到的有效峰个数为16个。因此，可以确定最优组合为A3B2C4D3。

由表3可知，A（平衡温度）影响极显著（P＜0.01），其他因素对结果影响不显著（P＞0.05），与极差分析结果相符合。因此，可以确定静态顶空-气质联用检测干红葡萄酒中香气成分的最佳条件为：平衡温度55℃，平衡时间35 min，样品量8 mL，NaCl添加量2.4 g。

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.3 葡萄酒香气成分检测方法优化前后分析

通过正交试验获得顶空/气-质联用检测干红葡萄酒中香气成分的最佳条件，在此最佳条件下，采用气相色谱-质谱法对干红葡萄酒中的香气成分进行检测，GC-MS分析优化前后总离子流色谱图见图5；通过NIST08标准谱库进行检索，对优化前后干红葡萄酒香气成分进行对比，结果见表4。

由表4可知，依据色谱保留时间和质谱信息等方法对干红葡萄酒香气成分进行定性分析，检测出优化前干红葡萄酒香气成分14种，其中酯类7种，分别为：乙酸乙酯、乙酸丁酯、乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、琥珀酸二乙基酯；醇类有6种，分别为：乙醇、丙醇、2-甲基丙醇、3-甲基丁醇、2,3-丁二醇、苯乙醇；1种酸：乙酸。检测出优化后干红葡萄酒香气成分18种，其中酯类9种、分别为：乙酸乙酯、乙酸-2-甲基丙酯、乙酸丁酯、乙酸-3-甲基丁酯、己酸乙酯、2-羟基-丙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、琥珀酸二乙基酯；醇类8种，分别为：乙醇、丙醇、2-甲基丙醇、丁醇、3-甲基丁醇、己醇、2,3-丁二醇、苯乙醇；1种酸：乙酸。

图5 干红葡萄酒香气成分检测条件优化前（A）和优化后（B）总离子流色谱图Fig.5 Total ion chromatogram of aroma components in dry red wine before(A)and after(B)optimization of determination conditions

表4 干红葡萄酒实验方法优化前后香气成分比较Table 4 Comparison of aroma components in dry red wine before and after optimization

干红葡萄酒香气成分检测方法优化后，检测出的香气成分比优化前多检测出4种，分别为：乙酸-2-甲基丙酯、正丁醇（香气醉人，酒精味）、2-羟基-丙酸乙酯和正己醇（青草味，吐司味）。各葡萄酒香气成分的相对含量采用气相色谱峰面积归一法进行定量。干红葡萄酒中醇类相对含量最高的是3-甲基丁醇，酯类相对含量最高的是乙酸乙酯。

3 结论

本研究以干红葡萄酒为研究对象，通过单因素试验分别考察平衡温度、平衡时间、样品量和NaCl添加量4个因素对干红葡萄酒香气成分有效峰个数的影响，采用正交试验对顶空/气-质联用检测干红葡萄酒中香气成分的条件进行优化。结果表明，静态顶空-气质联用检测干红葡萄酒中香气成分的最佳条件为：平衡温度55℃，平衡时间35 min，样品量8 mL，NaCl添加量2.4 g。在此条件下，鉴定出干红葡萄酒中的香气成分18种，其中醇类8种、酯类9种和1种酸。检测出的香气成分比优化前多出4种，分别为：乙酸-2-甲基丙酯、正丁醇（香气醉人，酒精味）、2-羟基-丙酸乙酯和正己醇（青草味，吐司味）。

本研究对静态顶空-气质联用检测葡萄酒香气成分进行优化，优化后检测出的香气成分比优化前多出4种，分别为：乙酸-2-甲基丙酯、正丁醇（香气醉人，酒精味）、2-羟基-丙酸乙酯和正己醇（青草味，吐司味）。与固相微萃取技术（SPME）检测结果比较，本试验方法在样品浓缩富集前处理上还需要进行改进，以建立一种快速、简单、灵敏度高、重现性及线性好的检测干红葡萄酒中挥发性香气成分的分析方法。

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Optimization of determination conditions of aroma components in wine by SHS/GC-MS

QI Xinchun,ZHANG Huining*,WEI Leipeng,BAI Chunyan
(Shanxi Chateau Rongzi,Co.,Ltd.,Xiangning 042100,China)

Volatile aroma components in wine were determined by static headspace-gas chromatography-mass spectrometer(SHS/GC-MS).The effects of equilibrium temperature,time,sample volume and NaCl addition on the effective peak number of aroma components in dry red wine were investigate by single factor experiments.Using the effective peak number(matching degree＞85%)as the evaluation index,the determination conditions of aroma components were optimized by orthogonal experiments.The results showed the optimum determination conditions of aroma components in dry red wine by SHS/GC-MS were as follows:equilibrium temperature 55℃,time 35 min,sample volume 8 ml and NaCl addition 2.4 g.Under this condition,18 kinds of aroma components in dry red wine were identified,including 8 kinds of alcohols,9 kinds of esters and one kind of acid.

wine;aroma components;condition optimization;SHS/GC-MS

TS262.6

0254-5071（2017）09-0168-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.036

2017-05-22

祁新春（1983-）男，酿酒师，本科，主要从事葡萄及葡萄酒的研究工作。

*通讯作者：张会宁（1974-），女，工程师，硕士，主要从事葡萄及葡萄酒的研究工作