响应面优化HS-SPME-GC/MS检测啤酒微量酯类物质条件

许 杨，王德良*，李 红，闫寅卓，宋 涛

（中国食品发酵工业研究院，北京 100015）

响应面优化HS-SPME-GC/MS检测啤酒微量酯类物质条件

许 杨，王德良*，李 红，闫寅卓，宋 涛

（中国食品发酵工业研究院，北京 100015）

该研究采用Plackett-Burman和Box-Behnken试验设计，对顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法（HS-SPME-GC/MS）检测啤酒中6种低含量酯类物质（辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯和3-苯基丙酸乙酯）的萃取条件进行优化，发现萃取温度、萃取时间和平衡温度为主要影响因素，通过响应面法分析得出最佳萃取条件为：萃取温度42℃、萃取时间30 min和平衡温度48℃；在该条件下，结合内标法定量，该方法的相关系数R2为0.990 0～0.999 9，回收率为93.43%～103.37%，检测限为0.01～0.05 μg/L，相对标准偏差（RSD）为1.75%～8.24%，表明该方法准确可靠，可应用于啤酒中微量酯类物质的检测。

啤酒；微量酯类物质；顶空固相微萃取-气相色谱质谱法；响应面法；检测分析

啤酒中的挥发性风味成分包括醇类、酯类、醛类、酮类、硫化物等[1]。其中，高级醇和酯类对啤酒质量至关重要。啤酒中酯类含量远不及高级醇，但是酯类物质具有更高的风味贡献度[2]。啤酒中的酯类，按其挥发性又可分为挥发性酯和非挥发性酯。酯类通常具有很强的“果香味”[3]，适量的酯能使酒体丰满，香味协调[4-5]。酯类含量过高赋予啤酒不舒适的苦味和果味，过低则使啤酒淡寡[6]，影响啤酒风味的协调性[7-8]。另外，DAAN S等[9]发现酯类对老化物质有掩蔽作用，向比利时贮藏啤酒中添加乙酸异戊酯，可以提高2-甲基丁醛、甲硫基丙醛、苯乙醛等老化物质的阈值，因此可以有效掩盖啤酒中老化物质带来的不愉悦的气味。

现在关于啤酒中酯类风味贡献度的研究主要集中在乙酸乙酯、乙酸异戊酯等几个主要酯类物质[10-11]，其他阈值低、啤酒中含量也低的某些特征酯类物质有待进一步研究分析。前期采用顶空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）-结合气相色谱-嗅闻-质谱法（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GCO-MS）[12-14]对市售不同品牌贮藏啤酒进行检测分析，发现辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯和3-苯基丙酸乙酯等6种酯香气较愉悦。这些酯类因其含量较少，无法一次性全面对其定性定量检测分析，对深入研究啤酒中含量较低的酯类物质的风味贡献度造成了困难。

采用固相微萃取对目的物进行富集过程中，影响萃取效率的因素很多，如萃取柱极性、萃取温度、萃取时间、解吸时间等[15-16]。响应面法可反映自变量变化对响应值的影响，并且可以分析自变量之间的相互作用，得到最优检测条件[17-18]。本研究采用Plackett-Burman和Box-Behnken试验设计优化检测啤酒中酯类物质的萃取条件。在获得的最优萃取条件下，结合内标法，建立了同时测定辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯和3-苯基丙酸乙酯6种酯类风味化合物的方法。在这些酯类中，如辛酸乙酯、乙酸异丁酯和乙酸苯乙酯具有较愉悦的香气特征[19]，以期提升啤酒的香气，可用于啤酒风味、新产品研发等多个领域，对实际生产有重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

市售啤酒A：产地武汉；啤酒B、啤酒C：产地北京。

NaCl（分析纯）、无水乙醇（色谱纯）：北京化工厂；2-壬醇（纯度≥98%）：美国Fluka公司；辛酸乙酯、乙酸异丁酯、丁酸乙酯（纯度均≥98%）：比利时Acros Organics公司；乙酸苯乙酯（纯度≥98%）：美国Sigma公司；苯甲酸乙酯（纯度≥98%）：梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；3-苯基丙酸乙酯（纯度≥98%）：北京百灵威科技有限公司。

1.2 仪器与设备

Clarus 600型气相色谱-质谱联用仪：美国PerkinElmer公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头及萃取手柄：美国Supelco公司；AUX 320分析天平：日本岛津公司；Xutemp恒温水浴锅：杭州雪中炭恒温技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 标准试剂的制备

标准溶液的配制：准确配制质量浓度为10 mg/L的辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯和3-苯基丙酸乙酯标准储备液，然后再用无水乙醇配分别配制成0.25 mg/L，0.50 mg/L，1.00 mg/L，2.00 mg/L的混合标准工作液，4℃避光处保存待用。

内标储备液的配制：准确移取2-壬醇，用无水乙醇配制成10 mg/L的内标储备液，然后再用无水乙醇配制成2.00 mg/L标准工作液，4℃避光处保存待用。

1.3.2 样品中挥发性风味物质的提取

啤酒预先在4℃冰箱冷藏24 h，取10 mL样品瓶依次加入3.0 g NaCl、5.0 mL啤酒样品、0.3 mL 2-壬醇内标溶液，放入磁力搅拌转子，加垫密封，样品在一定温度下平衡。平衡结束后，插入SPME萃取头，萃取头暴露于样品瓶顶空部分，萃取一定时间。萃取结束后，将SPME萃取头迅速插入GC进样口中，在250℃不分流模式下解吸。

1.3.3 GC-MS分析条件

气相色谱条件：WAX ETR毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.50 mm）；进样口温度220℃；载气为氦气，恒定流速1.2 mL/min；不分流进样；柱箱升温程序为：初始温度40℃，保持3 min，以5℃/min升至215℃，保持3 min。

质谱条件：电子电离（electron ionization，EI）源；电子能量70 eV，传输线温度280℃，离子源温度230℃；四级杆温度150℃；溶剂延迟3 min；质谱扫描范围40～600 u。

将实验谱图与美国国家标准及技术研究所（national institute of standards and technology，NIST）质谱数据库比较和标样定性两种方法结合进行组分定性。在优化的萃取条件下，采取内标法对6种特征酯类物质进行定量分析。

2 结果与分析

2.1 Plackett-Burman试验设计

选取进样量（X1）、解吸时间（X2）、搅拌速率（X3）、平衡温度（X4）、平衡时间（X5）、萃取温度（X6）、萃取时间（X7）和NaCl添加量（X8）8个因素作为自变量，每个因素选取高低（1和-1）2个水平，采用Plackett-Burman设计找出对风味物质峰面积（主要包括酯和醇）有显著影响的因子，其因素与水平设计见表1。响应值为风味物质（酯和醇）色谱峰面积（Y），Plackett-Burman试验设计与结果见表2。利用Design Expert 8.0.6对试验数据进行分析，结果见表3。

表1 Plackett-Burman试验设计因素与水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

表2 Plackett-Burman试验设计与结果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

由表3可知，萃取温度、萃取时间、平衡温度3个因素经过分析确定为极显著（P＜0.01），而NaCl添加量显著性分析为对结果影响显著（P＜0.05）。因此，选取萃取温度、萃取时间和平衡温度作为主要影响因素进行响应面分析。

表3 Plackett-Burman试验结果显著性分析Table 3 Significance analysis of Plackett-Burman experiments results

2.2 Box-Behnken试验设计优化参数水平

通过Plackett-Burman试验设计获得萃取温度（A）、萃取时间（B）、平衡温度（C）为主要影响因素。以酯类物质总峰面积（Z）为响应值，进行3因素3水平的Box-Behnken试验设计，因素与水平见表4，试验设计及结果见表5，方差分析见表6。

表4 Box-Behnken试验因素与水平Table 4 Factors and levels of Box-Behnken experiments

表5 Box-Behnken试验设计与结果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

表6 回归模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

利用Design Expert对试验数据进行多元回归分析，得到回归拟合方程如下：

Z=47.23-1.39A-11.39B+1.05C+7.26AB+0.28AC+2.25BC-5.41 A2-8.24B2-2.50C2

由表6可知，萃取时间对结果影响极显著（P＜0.01），且萃取时间的二次项、A和B的交互作用对结果影响显著（P＜0.05），模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），表明所建立的模型可用于啤酒中酯类物质总峰面积的分析。

根据回归方程绘制响应面分析图，以确认萃取温度、萃取时间和平衡温度对啤酒中酯类检测的影响，响应面曲线和等高线如图1所示。

由图1可知，萃取温度与萃取时间交互作用显著，与表6中交互项P值的分析结果一致。响应面的坡度较为陡峭，表明酯类物质的响应值对萃取时间和萃取温度的变化较为敏感。在萃取温度不变的条件下，随着萃取时间的延长，酯类物质响应值降低；在萃取时间不变的条件下，随着萃取温度的升高，酯类物质响应值呈现先略微上升然后下降的变化趋势。

采用Designer Expert软件分析，酯类物质固相微萃取最佳萃取条件为萃取温度41.95℃、萃取时间30 min、平衡温度47.12℃，在此条件下，酯类物质总峰面积的预测值为54.05×107。考虑到实际操作方便性，本试验所得固相微萃取最佳检测条件为萃取温度42℃、萃取时间30 min、平衡温度48℃。

为了检测所得结果的可靠性，在上述优化的条件下进行3次平行试验，即萃取温度42℃、萃取时间30 min、平衡温度48℃，实际检测平均酯类物质总峰面积为53.79×107，理论值与实验值的相对偏差为0.48%，表明应用响应面法 优化固相微萃取条件检测啤酒中酯类物质是可行的。

图1 萃取温度、萃取时间和平衡温度交互作用对酯类物质总峰面积影响的响应面及等高线Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between extraction temperature,extraction time and equilibrium temperature on the total peaks area of esters

2.3 模型方法学考察

本研究采用内标法对6种酯类物质进行定量，同时进行精密度和准确度试验。

由表7可知，6种酯类物质的回收率为93.43%～103.37%，相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为1.75%～8.24%，满足检测分析要求，并且重现性良好。以3倍信噪比（S/N=3）对应浓度为分析物的最低检测浓度进行检测限研究，检测限在0.01～0.05 μg/L内。依次取1.3.1中不同稀释倍数标准溶液，以标准溶液的质量浓度与峰面积响应值进行线性拟合，相关系数R2为0.990 0～0.999 9，表明6种分析物的线性回归方程在所测质量浓度范围内具有良好的线性相关性。

表7 啤酒中6种酯类物质的回收率、检测限和回归方程Table 7 Recovery rate,detection limit and regression equation of six esters in beer

2.4 市售啤酒中6种特征酯类物质的检测

按照本研究所建立的方法，对3种市售啤酒中6种特征酯类物质的含量进行3次检测，结果见表8。

表8 3种市售啤酒中6种酯类物质含量Table 8 Contents of six esters in three kinds of commercial beer

由表8可知，5种酯类检测结果相对标准偏差≤10%，因苯甲酸乙酯含量较低，所以检测误差会相对偏高，但整体检测误差仍在合理范围内，说明优化萃取条件后的检测方法准确可靠，可以应用于啤酒中6种低含量酯类物质定性定量检测。不同品牌啤酒的特征酯类物质的含量不同，这可能与酵母品种、酿造工艺以及贮存条件有关[20]。

3 结论

本研究采用响应面法对顶空固相微萃取-气相色谱-质谱法检测啤酒中6种酯类物质（辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯和3-苯基丙酸乙酯）的萃取条件进行优化，通过响应面分析得较佳的萃取条件为：萃取温度42℃、萃取时间30min和平衡温度48℃。同时采用标准加入法定量，6种分析物的线性回归方程在所测浓度范围内具有良好的线性相关性，相关系数R2为0.9900～0.9999，回收率为93.43%～103.37%，检测限在0.01～0.05 μg/L，满足检测分析要求。对实际啤酒生产中酯类物质的检测具有重要的指导意义。

[1]MEILGAARD M C.Prediction of flavor differences between beers from their chemical composition[J].J Agric Food Chem,2002,30(6):1009-1017.

[2]江 伟，李 红，周 梅，等.采用GC-MS同时检测啤酒中的醋酯类老化物质[J].食品与发酵工业，2011，36（10）：153-158.

[3]吕 微，付有利，李家辉，等.酯类物质含量对啤酒风味影响的研究[J].食品科技，2007，32（8）：101-103.

[4]吴文林.浅谈影响啤酒中酯类含量的因素及控制措施[J].啤酒科技，2015（4）：33-34.

[5]孙丽萍，樊金梁，王德良.啤酒生产过程中酯类的形成以及影响因素[J].酿酒，2002，29（4）：58-59.

[6]王海明.影响啤酒总酯水平的单因素分析及验证[J].酿酒，2015，42（1）：47-51.

[7]HILARY A B.Ester formation in brewery fermentations[J].J Inst Brew,1990(6):327-331.

[8]VERSTREPEN K J,DERDELINCKX G,DUFOUR J P,et al.Flavor-active esters:Adding fruitiness to beer[J].J Biosci Bioeng,2003,96(2):110-118.

[9]DAAN S,DAVID P.SCHUTTER D,et al.Contribution of staling compounds to the aged flavour of lager beer by studying their flavour thresholds[J].Food Chem,2009,114(4):1206-1215.

[10]石金飞.啤酒酿造过程中酯类物质影响因素的初步研究[D].无锡：江南大学，2008.

[11]SAERENS S M,DELVAUX F,VERSTREPEN K J,et al.Parameters affecting ethyl ester production bySaccharomyces cerevisiaeduring fermentation[J].Appl Environ Microbiol,2008,74(2):454-461.

[12]FAN W L,XU Y.Characteristic aroma compounds of Chinese dry rice winebygaschromatography-olfactometryand gaschromatography-mass spectrometry[J].ACS Symp Ser,2012,1104:277-301.

[13]闫 鹏，尹 花，董建军.动态顶空检测技术定量啤酒中乙酯类物质[J].啤酒科技，2017（1）：33-36.

[14]PINHO O,FERREIRA I M,SANTOS LH.Method optimization by solidphase microextraction in combination with gas chromatography with mass spectrometry for analysis of beer volatile fraction[J].J Chromatog A,2006,1121(2):145-153.

[15]胡国栋.顶空固相微萃取技术及其在啤酒香味研究中的应用[J].啤酒科技，2004（9）：12-15.

[16]ALISSANDRAKIS E,TARANTILIS P A,HARIZANIS P C,et al.Aroma investigation of unifloral Greek citrus honey using solid-phase microextraction coupled to gas chromatographic-mass spectrometric analysis[J].Food Chem,2007,100(1):396-404.

[17]CAPANZANA M V,BUCKLE K A.Optimisation of germination conditions by response surface methodology of a high amylose rice(Oryza sativa)cultivar[J].LWT-Food Sci Technol,1997,30(2):155-163.

[18]李永仙，刘春凤，董建军，等.响应面分析法优化顶空固相微萃取-气相色谱法检测啤酒中的挥发性风味物质[J].中国酿造，2008，27（12）：74-78.

[19]SAERENSSMG,DELVAUXFR,VERSTREPENKJ,etal.Production and biological function of volatile esters inSaccharomyces cerevisiae[J].Microb Biotechnol,2010,3(2):165-177.

[20]薛业敏.啤酒发酵中酯类的形成与控制[J].中国酿造，2002，21（3）：7-9.

Optimization of HS-SPME-GC/MS conditions for determination of trace esters in beer by response surface method

XU Yang,WANG Deliang*,LI Hong,YAN Yinzhuo,SONG Tao
(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100015,China)

The six low-content esters(including ethyl caprylate,ethyl butyrate,isobutyl acetate,phenylethyl acetate,ethyl benzoate and ethyl 3-phenylpropion)were extracted and determined by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry(HS-SPME-GC/MS).The extraction conditions were optimized by Plackett-Burman and Box-Behnken experiments.The result showed that extraction temperature,extraction time and equilibrium temperature were identified as the main factors.Through response surface methodology analysis,the optimum extraction conditions were temperature 42℃,time 30 min and equilibrium temperature 48℃.Under the conditions,combined with the internal standard method to quantify,the R2of the method was 0.990 0-0.999 9,the recovery rate was 93.43%-103.37%.The limit of detection was 0.01-0.05 μg/L.The relative standard deviation(RSD)was 1.75%-8.24%,which indicated that the method was accurate and reliable,and could be applied to the determination of trace esters in beer.

beer;trace esters;HS-SPME-GC/MS;response surface methodology;detection and analysis

TS261.7；O657.63；O658.2

0254-5071（2017）09-0163-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.035

2017-05-15

国家自然科学基金（31401680）

许 杨（1993-），男，硕士研究生，研究方向为发酵工程。

*通讯作者：王德良（1972-），男，教授级高级工程师，博士，研究方向为发酵工程。