共刺激分子CD28及CTLA-4的表达与不明原因反复流产的相关性研究

吴杰儒，李俊明，廖灿

(1、江西省妇幼保健院，江西 南昌330006；2、南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌 330006)

共刺激分子CD28及CTLA-4的表达与不明原因反复流产的相关性研究

吴杰儒1，李俊明2，廖灿1

(1、江西省妇幼保健院，江西 南昌330006；2、南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌 330006)

目的 探讨CD28、CTLA-4在母胎界面的表达与原因不明复发性流产 (URSA)的关系。方法 采集20例诊断为URSA的患者(URSA组)和20例正常早孕妇女(正常对照组)的部分蜕膜组织，采用Real-Time PCR检测蜕膜组织中CD28、CTLA-4mRNA的表达；流式细胞术检测蜕膜组织CD3+T细胞中CD28、CTLA-4的表达。结果 蜕膜组织中CD28mRNA的相对表达量 URSA组 （8.51×10-6±4.97×10-6） 较正常对照组高 （6.82×10-6±7.02×10-6）， 但无显著差异。 蜕膜组织中 CTLA-4 mRNA 的相对表达量 URSA 组（2.35×10-4±3.17×10-4）较正常对照组（2.09×10-5±2.79×10-5）显著增高，差异有统计学意义(P＜0.05)；URSA组CD28/CTLA-4比值显著降低（P＜0.05）。蜕膜组织中CD3+CD28+T淋巴细胞亚群URSA组（65.0±7.15%）高于正常对照组（59.2±4.51%），差异无统计学意义。蜕膜组织中CD3+CTLA-4+T淋巴细胞亚群URSA组（4.54±3.95%）高于对照组（2.11±1.57%），差异有统计学意义(P＜0.05)。结论 蜕膜组织中CD28/CTLA-4的表达异常可能与URSA的发病具有密切关系。

CD28；CTLA-4；原因不明复发性流产；蜕膜组织

自然流产是妊娠的常见结局之一，自然流产给每一个家庭和女性本身都带来很大的困扰，自然流产发生的危险随着妊娠丢失次数的增加而增加，其复发率受多种因素影响。除常见的胚胎染色体异常、生殖道解剖异常、内分泌异常、自身免疫疾病以及感染等因素外，临床上40%～50%的患者流产原因不明确，称为不明原因反复流产（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）。 随着相关研究的不断深入，不明原因反复流产80%以上都与免疫因素有关，主要与妊娠免疫耐受失衡相关[1]。本研究采用RT-PCR和流式细胞术对URSA患者和正常早孕妇女的蜕膜组织中CD28、CTLA-4的表达进行检测分析，以探讨其表达情况与URSA发生中的作用和意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象URSA实验组选择2015年7月至2016年6月期间在江西省妇幼保健院就诊同意纳入研究的URSA患者。患者既往无活产史，均排除染色体异常、生殖道解剖异常、内分泌异常、自身免疫性抗体、ABO血型不合、凝血功能异常以及感染等因素；经临床症状、妇科检查、尿HCG、B超诊断为早期胚胎停止发育或难免流产者，年龄30.2±3.1岁，孕周8.3±2.5周，孕次3.2±0.6次。另选取选择同期要求行人工流产的正常健康早孕妇女20例作为对照。对照组妇女既往均有活产史，无自然流产、死胎或死产史；排除染色体异常、内分泌紊乱、生殖道感染以及自身免疫性疾病；孕期无腹痛及阴道出血；B超提示胚胎发育正常。年龄27.5±3.8岁，孕周 7.8±2.2周，孕次 2.5±0.5次。

1.2 标本采集无菌采集研究对象的部分蜕膜组织，以磷酸缓冲液（PBS）浸泡，一部分置入含有RNA保存液的冷冻管中，4℃过夜后置-80℃保存备用，另一部分在2～4h内进行单个核细胞的分离。

1.3 蜕膜组织单个核细胞的分离和检测无菌采集蜕膜组织后，PBS漂洗后用眼科剪分离成大约100mg大小，经200目筛网过滤后，获取细胞悬液。离心后用Ficoll分离液梯度离心得到白色絮状细胞层，再裂解红细胞，离心洗涤得到蜕膜组织单个核细胞。然后分别用藻红蛋白-得克萨斯红(ECD)、异硫氰酸荧光素（FITC）、藻红蛋白（PE）标记（美国eBioscience公司），同时设同型对照抗体；混匀后避光孵育30min，PBS洗涤，重悬后上机 （贝克曼FC500）。

1.4 RT-PCR检测蜕膜组织中CD28/CTLA-4基因的表达取蜕膜组织约100mg，加入1ml TRIzol（Ambion公司）后匀浆，提取RNA，提取后的样本以260/280nm检测吸光度以判定纯度。按Takara试剂说明书进行逆转录和RT-PCR反应。CD28引物序列：5'-CTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGT-3'（上游）；5'-CATAGGGCTGGTAATGCTTGCGGGT-3'（下游）；CTLA-4 引物序列：5'-CATGATGGGGA ATGAGTTGA-3' （上游）；5'-AGGTAGTATGGCGGTGGGTA-3'（下游）；每个样品设三个复孔。结果采用2-△Ct法分析蜕膜组织中CD28/CTLA-4 mRNA的相对表达量。

1.5 FCM分析用流式细胞仪检测淋巴细胞表面共刺激分子，先在FSC和SSC二位点阵图选取淋巴细胞区域，然后再以FL1(FITC)和FL2(PE)分别检测FITC和PE阳性的CD3+T淋巴细胞表面共刺激分子的表达，每个样本测定30000个细胞数。用flowjo软件分析相关检测数据。

1.6 统计学分析采用SPSS 17.0进行统计学分析，采用Student's t-test方法对平均数之间的差异进行对比分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CD28mRNA、CTLA-4mRNA在URSA组和正常对照组蜕膜组织中的表达及其比值分析 URSA组中CD28mRNA的相对表达量较正常组增高，但差异无统计学意义，URSA组中CTLA-4 mRNA的相对表达量显著高于正常组 （P＜0.05），URSA组CD28/CTLA-4比值显著小于正常对照组 （P＜0.05）。 见表 1。

表1 CD28m RNA、CTLA-4 mRNA在蜕膜组织中的相对表达量及CD28/CTLA-4比值

2.2 CD28、CGTLA-4 及 CD28/CTLA-4 比值在URSA组、正常对照组人群在蜕膜组织CD3+T细胞上表达比例分析 URSA组患者CD3+CD28+T细胞表达比例高于正常对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05），URSA 组患者 CD3+CTLA-4+表达比例高于正常对照组 （P＜0.05），CD28/CTLA-4 比值显著降低（P＜0.05）。 见表 2、图 1。

3 讨论

表2 CD28、CGTLA-4及CD28/CTLA-4比值在蜕膜组织CD3+T细胞表达比例

图1 流式细胞技术检测CD3+T淋巴细胞上CD28、CTLA-4的表达

正常妊娠过程中，胚胎可以看作是一种特殊的同种异体移植物。有研究显示，正常的妊娠建立和维持取决于母体免疫系统尤其是子宫局部的免疫细胞能否识别并耐受胚胎抗原，而母体免疫系统对胚胎的识别受免疫细胞和细胞因子的调节。大量研究表明[2-4]，正常妊娠免疫主要以Th2型细胞因子介导的体液免疫为主，Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等介导B细胞增殖、抗体产生和同种排斥反应的免疫耐受。而妊娠失败主要由Th1型细胞因子介导的细胞免疫所致，Th1主要分泌IL-2、IFN-α、TNF-β 等，有免疫杀伤作用。T 细胞作为主要的免疫细胞在免疫耐受中起着重要作用，在获得性免疫应答的起点和核心。根据免疫双信号学说，参与获得性免疫应答的主要细胞T淋巴细胞的活化需要两个信号系统共同参与。第一信号由抗原提呈细胞表面的MHC/Ag复合物与相应细胞的抗原识别受体 (如T淋巴细胞的TCR/CD3)结合后提供，第二信号则由APC上的共刺激分子与淋巴细胞上相应的受体结合后介导。研究证明，淋巴细胞接触MHC/Ag复合物后可能产生两种截然不同的后果：⑴增殖、分化为不同的效应细胞；⑵无反应性或凋亡。这两种结果的出现以及T细胞分化的方向主要决定于APC所传递的共刺激信号。

CD28/CTLA-4作为最重要的共刺激分子功能各有不同，CD28与B7结合后激活T细胞，促进T细胞克隆增殖；CTLA-4则相反是T细胞活化的抑制性分子。CD28在T细胞上为组成性表达，在静息和活化状态下都有表达，当它与B7结合以后能诱导产生细胞因子及其受体的表达。CTLA-4则不同，在静息的T细胞上几乎不表达，当T细胞被激活时，CTLA-4会出现高表达状态，负调节共刺激信号，行使对T细胞自我稳态调节[5]。CD28和CTLA-4与B7的结合反应了免疫的精细调节，即T细胞免疫应答开始时需要CD28的介导，而CTLA-4则对过度活化的T细胞起到抑制作用，使整个免疫应答处于平衡状态。CTLA-4除了传递负性调节信号还起到其他免疫调节作用：⑴可提高T细胞活化的阈值，避免发生自身免疫反应[6，7]；⑵参与Th2细胞的分化，在缺乏CTLA-4的情况下，初始T细胞优先向Th2分化，并分泌较高水平的IL-4、IL-5、IL-10[8，9]。 CTLA-4 的抑制机制也分为两种，在免疫起始阶段低水平表达时借助TCR处于激活状态与胞内信使分子SHP-2、PP2A等直接传递抑制性信号；当CTLA-4高表达时可直接与CD28竞争结合B7分子，结合后阻断CD28分子作用发挥，通过导致T细胞的无能或凋亡使免疫反应终止[10]。

本研究通过检测URSA患者蜕膜组织mRNA和蜕膜组织中CD3+T细胞上CD28、CTLA-4的表达发现。URSA组的CD3+CD28+表达高于正常对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；CD3+CTLA-4+也高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明CD3+CTLA-4+的高表达与URSA的发生相关，而CD3+CD28+表达无差异与URSA的发生不具有直接的相关性。在普遍的认识中，CD28是正向调节的共刺激分子，根据这个推论在URSA患者蜕膜组织中浸润的T细胞应该高表达CD28，局部T细胞过度活化导致URSA的发生。而本研究的结果CD28虽然在URSA组高于对照组但差异无统计学意义。说明正常妊娠妇女蜕膜组织中的CD28也处于活化状态。这与我们所认知的CD28和CTLA-4所具备的功能不符。在自身免疫疾病中往往表现为CD28高表达、T细胞过度激活而CTLA-4低表达，这类自身免疫疾病的机理得到广泛承认，而在移植排斥反应中，非急性排斥反应和急性反应相比共刺激分子活性较低[11]。本研究的结果不符可能与URSA的发病机理不同有关，且不排除还受其他因素影响。其次本研究的样本数不大可能也会影响研究结果。本研究的样本都是在刮宫后两小时取得的，从免疫学的角度来看，这些样本应该是发生了排斥反应共刺激分子应该处于高表达状态。现代生殖免疫学认为[12]，正常的妊娠母胎之间是处于免疫耐受的，以保证妊娠顺利进行；而免疫耐受需要适量的免疫识别和免疫反应，这种适量的免疫识别、反应引起的免疫耐受是一个主动的免疫过程，所以T细胞是产生免疫耐受的重要环节。在正常情况下CD28表达的增加，引起的T细胞活性增加，不会对胎儿直接进行排斥反应而是通过多因素调节维持宫内的免疫耐受平衡状态，是有利于妊娠进行的。而CTLA-4在URSA组的高表达反映了，在URSA患者中T细胞的功能反而被抑制了。由于CD28/CTLA-4具有共同的配体B7，我们单独比较CD28和CTLA-4对于解释T细胞的功能，会受到许多因素的干扰。所以本研究把CD28/CTLA-4的比值再做比较，通过比较正负调节因子的比值来解释T细胞功能的调节方向以减少干扰因素，另一方面对于同一患者采用比值来比较更能说明对T细胞的调节作用。如某个体的CTLA-4很高，但CD28也很高，它的抑制作用肯定不如CTLA-4表达很高而CD28表达一般的那么强[13]。本研究发现CD28/CTLA-4比值URSA组显著低于正常对照组，这提示我们在URSA组中母胎界面的T细胞功能是处于相对抑制状态的，而正常对照组中处于相对活跃状态。这也证明在孕期母体对胎儿的同种异体抗原进行免疫识别和免疫应答，来诱导维持正常妊娠的免疫耐受，免疫耐受并不是完全不接触抗原，而是要接触识别抗原，然后再通过各种环节作用，使母体再次识别抗原时不产生免疫效应，这个过程也是个主动的免疫过程。

也有研究显示在URSA患者中CD28是高表达而CTLA-4是弱表达的。如张利群等人研究[8]表明URSA组蜕膜组织的CTLA-4是显著低于妊娠组的；刘堂兵等人研究[14]发现孕早期自然流产患者的外周血CD28分子显著高于早孕期正常妊娠者。还有研究[15]发现通过干预共刺激分子信号使CD28表达下调和CTLA-4表达上调能显著降低自然流产模型的胚胎吸收率。以上研究显示在母胎界面CD28的高表达和CTLA-4的低表达造成了局部或外周血T细胞过度活化导致疾病的发生。这说明在整个妊娠过程中，免疫耐受的产生和平衡的维持都很重要。不管是T细胞被相对抑制造成免疫耐受没能正常适度发生还是T细胞过度活化导致免疫反应过度对胎儿造成排斥都有可能导致URSA的发生。同时T细胞的分化既影响Th1/Th2的偏移也反过来受其影响，而T细胞又受共刺激分子的作用而发生分化。CTLA-4的高表达与B7结合诱导T细胞Th1极化，Th1型细胞因子对正常妊娠的维持是不利的。

总的来说URSA的发生受多因素共同作用影响，导致疾病的发生。受条件限制本研究只从CD28和CTLA-4方面入手，发现相比CD28，CTLA-4在URSA发生中起到更重要的作用，同时CD28/CTLA-4比值提示我们局部T细胞被相对抑制也可能会导致URSA的发生。通过调节共刺激分子通路，使T细胞的免疫功能正常发挥，保持母胎免疫耐受的平衡，可作为研究共刺激分子与URSA患者相关性的新方向。

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R714.21，R446.62，R523

A

1674-1129(2017)05-0667-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.010

江西省卫生计生委科技计划（项目编号：20165454）

吴杰儒，男，1983年生，主管技师硕士研究生，检验科，主要从事临床免疫检验诊断学的研究。

2017-01-20；

2017-08-09)