人类尿液来源干细胞的体外培养和生物学特性分析

牛鑫，张国威，汪泱

(上海交通大学附属第六人民医院，1、四肢显微外科研究所；2、神经外科，上海200233)

·论 著·

人类尿液来源干细胞的体外培养和生物学特性分析

牛鑫1，张国威2，汪泱1

(上海交通大学附属第六人民医院，1、四肢显微外科研究所；2、神经外科，上海200233)

目的 从人类尿液中直接分离能够体外大量扩增且具有多向分化潜能的干细胞，并研究其生物学特性。方法 收集志愿者尿液100～200ml，经离心后使用完全培养基重悬，接种于培养板中；克隆贴壁生长后换液。大量扩增后通过流式细胞术检测其表面标志物，使用成骨、成软骨诱导培养基对其进行诱导分化，通过茜素红染色、阿利新蓝染色检测诱导分化结果。结果 每100m l尿液经14d培养能够直接分离得到3～10个克隆，传代培养至第5代时可扩增至2～10×107个尿液来源干细胞，能够满足细胞治疗需要。尿液来源干细胞表面标志物CD29，CD44，CD73，CD90为阳性，CD34，CD45，HLA-DR为阴性，与间充质干细胞一致。经诱导培养后，尿液干细胞能够能够成骨、成软骨分化。结论 尿液来源干细胞具有间充质干细胞特性，可以作为细胞治疗、组织工程中的种子细胞。

尿液来源干细胞；间充质干细胞；种子细胞

细胞治疗是攻克危重疾病、修复难愈合损伤的新型疗法。干细胞因其增殖能力旺盛，具有多向分化潜能、能够分泌多种因子等生物学特性通常被选为细胞治疗的种子细胞。种子细胞的来源和培养是长期以来限制细胞治疗发展的关键因素。目前，可用于细胞移植疗法的种子细胞主要为胚胎干细胞、诱导多能性干细胞和骨髓、脂肪等多种组织来源的间充质干细胞 （mesenchymal stem cells，MSCs）。胚胎干细胞来源有限，培养方法复杂，面临伦理、成瘤问题以及异体移植的免疫排斥风险[1]；诱导多能性干细胞诱导、培养过程复杂，且有成瘤风险；骨髓、脂肪来源的间充质干细胞因其可以自体取材、成瘤风险低、且免疫排斥风险低，在细胞治疗中具有一定优势，并被广泛研究。例如，经研究证实，骨髓来源间充质干细胞能够在体外直接分化为神经元[2]；在体内实验中，骨髓来源间充质干细胞能够迁移至缺血半影区[3]。此外，骨髓来源间充质干细胞还能够促进血管生成[4，5]，抑制凋亡[6]，分泌营养因子[7]。将骨髓来源间充质干细胞自体移植，能够显著促进糖尿病足坏死创面的愈合[8]。但是，骨髓、脂肪来源间充质干细胞取材过程有创，给病人造成额外痛苦和负担。因此，寻找来源无创的移植种子细胞一直是干细胞研究领域持续关注的热点问题。

尿液能够作为检测、诊断多种疾病的生物样本，蕴含丰富的代谢产物、生物大分子、囊泡、细胞等内容物[9-12]，并且能够无创、大量获取。鉴于此，我们尝试从尿液中获取干细胞。经过摸索，我们建立了从尿液中直接分离培养干细胞，即尿液来源干细胞（urine-derived stem cell，USCs）的新体系。 我们利用特性成分培养基，通过简单离心，从人体尿液中分离得到一种干细胞，其可表达CD44、CD73、CD90、CD29等标志物，并具有多向分化潜能。尿液干细胞获取过程无创，获取过程简单，且能够多次无限量获取，从而为干细胞的研究和利用增加了一个极其安全、便利的细胞来源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 尿液由成年健康志愿者捐赠捐赠过程符合上海市第六人民医院伦理委员会各项规定。捐赠者留取清洁中段尿液100～200ml，以备使用。

1.1.2 主要仪器生物安全柜 （Thermo），CO2培养箱（Thermo），离心机。

1.1.3 主要试剂100×antibiotic antimycotic（GIBCO，15240062），尿液干细胞完全培养基（DMEM/F12 培养基（Corning），优级胎牛血清（GIBCO）2%，EGF （Perprotech）10ng/ml，PDGF （Millipore）2ng/ml，TGF-beta（Perprotech）1ng/ml，bFGF （Perprotech）2ng/ml，氢化可的松（Sigma）0.5mM，胰岛素（GIBCO）25mg/ml，转铁蛋白（sigma）20mg/ml，肾上腺素549ng/mL，三碘甲状腺氨酸 125ng/ml），0.25%胰蛋白酶（含 EDTA）（GIBCO）， 磷酸缓冲液（PBS）（Corning），明胶（上海国药集团），多聚甲醛（上海国药集团），成骨诱导培养基（GIBCO），成软骨诱导培养基（GIBCO），茜素红（Sigma），阿利新蓝（Sigma）。 直 标 抗 体 ：CD34-APC(BD No.560940)，CD45-FITC(BD No.560976)，CD29-PE(BD No.561795)，CD44-FITC(BD No.560977)，CD73-PE(BD No.561014)，CD90-PE(BD No.560970)，HLA-DRPE(BD No.560943)。

1.2 方法

1.2.1 细胞分离将0.1%明胶按1.5ml/孔加入6孔板，置于CO2培养箱中，在37℃下静置2h完成包被。细胞接种前弃去明胶。取尿液样本后，按每100ml尿液加入 5ml 100×antibiotic antimycotic，充分轻柔混匀，400g离心10min；弃上清，使用PBS清洗沉淀物，然后再次400g离心10min。离心后弃去上清，每100ml尿液的沉淀物使用6ml尿液干细胞完全培养基重悬，并以0.2ml/cm2接种于包被过的培养板。接种次日观察样本是否污染，接种后7d更换完全培养基，并观察克隆。克隆生长至细胞紧密接触时使用0.25%胰蛋白酶（含EDTA）进行传代。

1.2.2 USCs表面标志物的鉴定 USCs传代培养至第4代，将融合度为90%的USCs消化至单个细胞，使用4%多聚甲醛在室温固定10min，200g离心5min弃去上清，使用PBS清洗，200g再次离心5min后弃去上清，重悬至适宜密度并按说明书推荐浓度加入直标抗体，并按说明书推荐时间、温度孵育；孵育后200g离心5min，使用PBS清洗游离抗体，200g再次离心5min，将细胞重悬至200μl，经GUAVA easyCyte6HT检测。

1.2.3 USCs诱导分化USCs传代培养至第 5～7代，将融合度为100%的USCs弃去培养基，PBS清洗后更换成骨诱导培养基或成软骨诱导培养基进行诱导分化。诱导培养基隔天换液，诱导28d后分别进行染色。

1.2.4 茜素红染色将诱导后细胞弃上清，PBS清洗后使用4%多聚甲醛室温固定10min。洗净残留固定剂后加入0.1%茜素红溶液室温染色10min。PBS洗去浮色后于光镜下观察。

1.2.5 阿利新蓝染色将诱导后细胞弃上清，PBS清洗后使用4%多聚甲醛室温固定10min。洗净残留固定剂后加入阿利新蓝溶液室温染色30min。PBS洗去浮色后于光镜下观察。

2 结果

2.1 细胞分离培养结果尿液经离心、清洗、重悬，约80%的样品在接种后第5～7d开始出现克隆，即为USCs。USCs克隆通常为圆形，克隆内细胞主要为梭形（图1a）。部分克隆内偶有出现上皮样细胞，传代后此类细胞消失。接种14d后，每100ml尿液能够直接分离获得3～10个克隆。传代后，USCs细胞形态均一，呈梭形、涡旋状生长（图1b），符合间充质干细胞形态特点。传代培养至第5代时可扩增至2～10×107个USCs，并能够稳定传代至8代以上，能够满足细胞治疗需要。部分USCs贴壁后不呈现明显克隆状态（图1c，d），乃至成球生长，但仍可较快速生长，并被传代至8代以上。

图1 人类尿液离心后分离获得增殖旺盛的克隆（a）；传代培养后细胞生长旺盛，呈梭形涡旋状生长（b）；部分USCs贴壁时不呈现明显克隆状态，或成球生长（c，d）。标尺200μm。

2.2 细胞表面标志物检测结果将传代后USCs进行流式细胞术检测，发现USCs细胞表面高表达CD29（98.62%）、CD44（99.62%）、CD73（94.44%）、CD90（90.44%）等标志物，不表达 CD34（2.84%）、CD45(2.84%)、HLA-DR(2.12%)等标志物，符合间充质干细胞表面标志物特点（图2a-g）。因此，我们推断USCs具有间充质干细胞的特性，并且具有间充质干细胞必备的多向分化潜能。

图2 流式细胞术检测USCs表面标志物，其中CD29（a），CD44（c），CD73 （e），CD90 （f） 表达为阳性；CD34 （b），CD45（d），HLA-DR（f）表达为阴性。

2.3 细胞诱导分化结果我们将传代培养至5～7代的USCs进行成骨、成软骨诱导分化。USCs经28d成骨诱导之后，细胞间产生大量沉淀物，且沉淀物茜素红染色结果为阳性，证明沉淀为钙结节，USCs经诱导后已向成骨方向分化 （图3a）。USCs经28d成软骨诱导之后，细胞生长紧密，产生大量细胞间质，且阿利新蓝结果为阳性，证明已有大量糖蛋白产生，USCs有成软骨分化潜能（图3b）。

图3 USCs成骨诱导后经茜素红染色，呈现大量钙结节阳性（a），成软骨诱导后经阿利新蓝染色，呈现大量糖蛋白阳性（b）。标尺10μm。

3 讨论

细胞治疗的效果高度依赖于种子细胞的选择。终末分化细胞因其难以体外培养不宜作为种子细胞。胚胎干细胞难以获取，培养条件严苛，存在伦理问题，并且不可能获得自体细胞，因而使用后需面临免疫排斥风险。诱导多能性干细胞在诱导过程中可能使用病毒，并具有较强成瘤性，存在安全风险。因此，在体外能够大量增殖、并具有多向分化潜能、且成瘤性低的间充质干细胞表现出作为种子细胞的巨大优势。间充质干细胞通常从骨髓、脂肪等多种中分离获得[13-16]，能够自体获取，并长期作为细胞治疗的种子细胞使用。然而，骨髓来源、脂肪来源以及脐带血来源间充质干细胞取材过程有创，且来源有限，难以实现多次取材，限制其后续应用。在本项研究中，我们通过简单离心从人尿液中分离得到可以贴壁生长的USCs，其表面标志物与间充质干细胞一致，能够在体外大量扩增，并具有成骨、成软骨分化潜能。USCs在生物学特性上与间充质干细胞相当，且取材过程无创、简便，单次取材提供的细胞（2～10×107个）即可满足一般细胞治疗对种子细胞数量的要求。且USCs的来源决定治疗过程中能够对同一供体进行多次取材，可以满足长期、多次、多疗程治疗的需要，是理想的自体种子细胞来源，具有良好应用前景。已有的从尿液中分离细胞的研究[17]主要着眼于将其诱导为诱导多能性干细胞，对尿液来源细胞本身的特性、功能研究较少。我们的研究建立了从尿液中分离可多次传代、大量扩增的干细胞的技术体系，并细致分析了细胞表面标志物，测试了细胞的多向分化潜能，加深了对尿液来源细胞的认识，为细胞治疗提供了种子细胞新来源。

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In vitro Culture and Biological Characteristics of Urine-Derived Stem Cells

NIU Xin1，ZHANG Guowei2，WANG Yang1.
1.Institute ofMicrosurgery on Extremities，The Sixth People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University，Shanghai200233，China;2.Departmentof Neurosurgery，The Sixth People’s Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University，Shanghai200233，China.

Objective To directly isolate in vitro proliferative and multipotential stem cells from urine specimen and study their biological characteristics.M ethods 100～200m l urine were collected from volunteers，and further to centrifuged urine and resuspended the precipitate，then seeded the suspension into tissue culture plates.Changed fresh media after clones appeared.Detected cell surface markers through flow cytometry.Osteogenic and chondrogenic induction were performed followed by Alizarin Red S staining and Alcian Blue staining.Results We could isolated 3～10 clones from 100m l urine after cultured for 14 days.After subculturing to the fifth generation we harvest 2～10×107cells.These urine-derived stem cells expressed CD29，CD44，CD73 and CD90，but not expressed CD34，CD45 and HLA-DR，which is consistentwithmesenchymal stem cells.Conclusion Urine-derived stem cells have similar biological characteristics with mesenchymal stem cells，and could act as seed cells for cell therapy and tissue engineer.

Urine-derived stem cells；Mesenchymal stem cells；Seed cells

Q813.1+1，R446.62

A

1674-1129(2017)05-0638-04

10.3969/j.issn.1674-1129.2017.05.002

国家自然科学基金（No.81501863）；上海市第六人民医院院级课题（No.1634）

牛鑫，女，1984年生，硕士，研究实习员，研究方向为干细胞与再生医学。

汪泱，女，1963年生，教授，博士生导师，研究方向为干细胞与再生医学，Email：wangy63cn@126.com

2017-07-25；

2017-08-29)