耐高温β-甘露聚糖酶毕赤酵母菌M27-8发酵条件优化

熊 进，黄魁英，夏枫耿，陈舒洁，胡海艳

（广州市微生物研究所，广东广州 510663）

耐高温β-甘露聚糖酶毕赤酵母菌M27-8发酵条件优化

熊 进，黄魁英，夏枫耿，陈舒洁，胡海艳*

（广州市微生物研究所，广东广州 510663）

为获得产β-甘露聚糖酶发酵最佳条件，本研究以克隆筛选获得的产耐高温β-甘露聚糖酶的毕赤酵母菌M27-8菌株为研究对象，对不同氮源含量、葡萄糖含量、pH、发酵时间、接种量、温度和转速进行优化。结果表明：最佳产酶条件为6%玉米浆、3%葡萄糖、pH 5.5、发酵60 h、2%接种量、28℃、225 r/min，最大酶活达到452.7 U/mL，是优化前酶活138 U/mL的3.3倍。综上，此发酵培养基可用较廉价的玉米浆取代YPD培养基，从而节省成本，为工业生产奠定基础。

β-甘露聚糖酶；毕赤酵母；发酵条件；优化

甘露聚糖作为半纤维素的第二大组分（Scheller等，2010；St。albrand等，1993），广泛存在于木材和各种植物组织中（Kansoh等，2004）。β-甘露聚糖酶能够水解含有甘露聚糖的有机物，已经广泛应用于饲料、造纸、医药、食品、精细化工等领域（Kansoh 等，2004；Bhat等，2000）。 甘露聚糖酶因在饲料应用中对酶的纯度要求不高，无需精制纯化，通过简单的发酵生产并喷雾干燥获得酶粉，一般就可作为饲料添加物混合使用（Chen等，2005）。在常用饲料原料中半纤维素含量丰富，因其在单胃动物消化道内会形成凝胶状，从而影响畜禽吸收和饲料利用率（Nunes等，1992）。β-甘露聚糖酶可添至饲料中，消除其中甘露聚糖的抗营养作用，提高饲料利用率，并且可促进肠道内有益菌群的增殖，增强畜禽免疫力（Cerqueira等2011；Zou 等，2006）。

目前许多工业用酶，要求具有高活性酶的同时，还需要耐热和耐酸性条件，因此，获得耐热性、耐酸性的β-甘露聚糖酶菌株的研究成为热点。目前，表达耐高温、耐酸性β-甘露聚糖酶的菌株应用到工业化生产中的不多。本研究对构建组成型β-甘露聚糖酶毕赤酵母高效表达体系，筛选的高酶活、耐热性和耐酸性较强的β-甘露聚糖酶菌株M27-8为研究对象，对培养基成分及培养条件进行优化，提高该菌株的产酶水平，为进一步扩大生产奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 蛋白胨（贵州新华生化科技发展有限公司）、玉米浆干粉（山东康源生物科技有限公司）、酵母提取物（湖北安琪酵母股份有限公司）；葡萄糖、磷酸氢钠、磷酸氢二钾、琼脂等试剂为国产分析纯。毕赤酵母菌M27-8（Pichia pastoris M27-8），由广东省种质资源库提供。

DHZ-DA大容量全温振荡器（江苏省太仓市实验设备厂）；752N紫外可见分光光度计（上海精科仪器有限公司）；HR/T20M台式高速冷冻离心机（湖南赫西仪器装备有限公司）；XW-80旋涡混合仪 （海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；PHS-3C pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 试剂 PTM1微量元素：CuSO4·5H2O 6.0 g/L、NaI 0.08 g/L、MnSO4·H2O 3.0 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.2 g/L、H3BO30.02 g/L、CoCl20.5 g/L、ZnCl220.0 g/L、FeSO4·7H2O 65.0 g/L、 生物素 0.2 g/L、 浓 H2SO45.0 ml/L，过滤除菌。发酵培养基发酵前按照4.0 mL/L比例补充PTM1。

0.5%甘露聚糖溶液（pH5.0）：用pH 5.0磷酸二氢钾—磷酸氢二钠缓冲液配制0.5%甘露聚糖底物液。DNS溶液的配置参照农业部标准DNS试剂的配制。

YPD培养基：酵母提取物10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖10 g/L。

YPDS培养基：酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖10 g/L、琼脂20 g/L。

BSM培养基：葡萄糖 20 g/L、85%H3PO426.7 mL/L、KOH 4.13 g/L、（NH4）2SO44 g/L、CaCl20.38 g/L、K2SO418.2 g/L、MgSO4·2H2O 14.9 g/L、CaSO4·2H2O 0.93 g/L、PTM1 4.0 mL/L。

1.2.2 种子液的制备 实验室保存的毕赤酵母菌M27-8，转接入含 200 μg/mL Zeocin的 YPDS平板培养基中，28℃培养3 d，涂板。将平板培养基活化好的菌种，挑选单菌落接种到50 mL YPD液态培养基中，28℃、200 r/min振荡培养20～24 h，OD600达到6.0～8.0，镜检，视野中酵母菌饱满、均匀、单个或两个成串的培养液作为发酵种子液。

1.2.3 培养基成分优化

1.2.3.1 不同氮源对产β-甘露聚糖酶的影响。分别采用2%、4%、6% 浓度的BSM、棉籽粉、中温豆粉、玉米浆作为氮源，添加20 g/L的葡萄糖为碳源，以YPD培养基为对照。接种量2%、装液量50 mL/250 mL，转速200 r/min，用八层无菌纱布封口培养，28℃培养，72 h取样，测定β-甘露聚糖酶酶活。

1.2.3.2 不同玉米浆干粉含量对产β-甘露聚糖酶的影响。按照上述最佳条件，采用3%、4%、5%、6%、7%、8%、10%不同玉米浆含量的培养基进行发酵试验，5 moL/L氢氧化钠调节pH 5.0，其他条件同上。

1.2.3.3不同葡萄糖含量对产β-甘露聚糖酶的影响。按照上述最佳条件，采用1%、2%、3%、4%、5%不同葡萄糖含量的培养基进行发酵试验，5 moL/L氢氧化钠调节pH 5.0，其他条件同上。

1.2.4 培养条件优化

1.2.4.1 不同发酵液pH对产β-甘露聚糖酶的影响。按照上述最佳条件，用5 moL/L的氢氧化钠和10%磷酸调节初始pH，调节pH为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，以不调节 pH 为对照，每 12 h调节发酵液pH，其他条件同上。

1.2.4.2 不同接种量对产β-甘露聚糖酶的影响。按照上述最佳条件，采用1%、2%、5%、7.5%、10%接种量进行发酵试验，其他条件同上。

1.2.4.3 不同温度对产β-甘露聚糖酶的影响。按照上述最佳条件，设置两组分别在28℃和30℃下培养24 h，最后每组分别在24、28、32℃继续培养至72 h，其他条件同上。

1.2.4.4 不同转速对产β-甘露聚糖酶的影响。按照上述最佳条件，采用 150、175、200、225、250 r/min，其他条件同上。

1.2.5 胞外粗酶液的制备 取发酵物2～4 mL至离心管中，9000 r/min离心5 min，上清液为粗酶液。

1.2.6 β-甘露聚糖酶酶活测定 取直径15 mm的15 mL的洁净刻度试管分别标记空白组、对照组、测试组，分别加入1.5 mL pH 5.0的0.5%甘露聚糖溶液作为底物，45℃水浴预热5 min；测试组加入稀释适当倍数的预热酶液0.5 mL，在45℃水浴10 min，每隔2 min轻轻摇晃均匀；10 min后立即加入2 mL DNS溶液终止反应；然后仅在对照组中加入0.5 mL酶液，立即至于沸水中煮沸15 min,显色反应后，冷却至室温后用蒸馏水定容至15 mL，颠倒混匀；以空白管调零，在分光光度计540 nm波长处测吸光度。

酶活力单位（U）：在45℃、pH 5.0的条件下，每分钟水解底物产生1 μmol甘露糖所需的酶量为一个酶活单位。

1.2.7 甘露糖标准曲线 用pH 5.0磷酸二氢钾—磷酸氢二钠缓冲液配制 0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL不同浓度梯度，以甘露糖浓度为横坐标，吸光度为纵坐标线性拟合得到线性回归方程：Y=0.15502X-0.039，R2=0.99845。

2 结果与分析

2.1 不同氮源对产β-甘露聚糖酶的影响 在培养基中分别添加玉米浆干粉、棉籽饼粉、中温豆饼粉、BSM、YPD发酵72 h测定酶活。结果见图1。

图1 不同氮源对产β-甘露聚糖酶的影响

由图1可知，发酵最佳产β-甘露聚糖酶培养基是添加氮源YPD，酶活达到138.9 U/mL；其次是玉米浆干粉，6%含量的玉米浆干粉培养基发酵酶活达到111 U/mL，为YPD培养基发酵产酶的80%。棉籽饼粉和中温豆饼粉浓度也影响菌株产酶，当培养基中添加BSM时，几乎检测不到酶活；试验结果和Jia等（2012）报道的采用玉米浆干粉作为替代氮源时最佳结果相符。因玉米浆干粉相对蛋白胨和酵母膏作为氮源时廉价，故在上大型发酵罐时可以将其作为YPD培养基的取代物，节约生产成本。

2.2 不同玉米浆干粉含量对产β-甘露聚糖酶的影响 通过发酵72 h，测定发酵液中的酶活，结果见图2。随着玉米浆干粉含量增加，β-甘露聚糖酶产量先增后减；且玉米浆含量在6%～8%时，产酶相对平稳。这可能是玉米浆成分复杂，显酸性，含量过高时会抑制微生物产酶。最佳的玉米浆干粉含量在6%左右。

图2 不同玉米浆干粉含量对产β-甘露聚糖酶的影响

2.3 不同葡萄糖含量对产β-甘露聚糖酶的影响通过发酵72 h，测定发酵液中的酶活，结果见图3。随着葡萄糖含量增加，β-甘露聚糖酶酶活逐渐升高，且在3%后不再增加。这可能是葡萄糖含量过高，会产生葡萄糖抑制效应，从而抑制微生物的生长（Olaniyi等，2015）。最佳的葡萄糖含量为3%。

图3 不同葡萄糖含量对产β-甘露聚糖酶的影响

2.4 不同发酵液pH对产β-甘露聚糖酶的影响通过调节0～72 h发酵液中的pH，每12 h调pH一次，以不调pH作为对照，测定发酵液中β-甘露聚糖酶酶活，结果见图4。随着发酵时间的延长，β-甘露聚糖酶酶活基本保持增长的趋势。通过发酵过程中控制不同发酵pH，只有发酵pH 4.0较自然发酵效果差，其余效果都较对照好，其中pH为5.0、5.5、6.0效果最优，且三者之间酶活差别不大，说明发酵液pH值为5.0～6.0为产酶的适宜浓度，是不调pH产酶的2.5倍左右。

图4 不同发酵液pH对产β-甘露聚糖酶的影响

2.5 不同接种量对产β-甘露聚糖酶的影响 通过发酵96 h，测定发酵液中的酶活，结果见图5。随着发酵时间的增加，产酶基本保持较快增长的趋势；接种量不同，产酶差异不明显。在发酵过程中，只有接种量为1%时，前60 h和其他接种量有较大差异，说明接种量最少要控制在2%，才不会因为菌体浓度而影响产酶。

图5 不同接种量对产β-甘露聚糖酶的影响

2.6 不同温度对产β-甘露聚糖酶的影响 通过发酵72 h，测定发酵液中的酶活，结果见图6。前期两组分别在28℃和30℃培养24 h测定酶活，即图中28℃培养起始值和30℃培养起始值，30℃培养起始值曲线较28℃培养起始值曲线高，这可能是30℃培养更适合微生物前期生长，较利于产酶，故前期采用30℃培养较适宜。两组在28℃和30℃培养24 h后，后期分别至于24、28℃和30℃培养72 h测定酶活，发现后期培养温度越高越不利于产酶，且前期24 h在30℃培养后转入32℃培养至72 h时，酶活相较于其他条件下降得更快，可能是由于后期发酵温度过高，不利于微生物生长，导致蛋白质降解，对外源蛋白质的表达不利（Ye等，2008）。故后期采用不超过28℃培养较适宜。

图6 不同温度对产β-甘露聚糖酶的影响

2.7 不同转速对产β-甘露聚糖酶的影响 通过发酵72 h，测定发酵液中的酶活，结果见图7。随着时间的推移，酶活逐渐增加，且在发酵60 h之后，酶活保持稳定；随着转速增加，产酶前期48 h内保持增加趋势，后期逐渐平稳。发酵过程中转速越大，有利于促进溶氧，促进物质间的传递转化，有利于产酶。225 r/min和250 r/min在60 h后差异较小，且发酵周期缩短能够减少生产成本，如果采用225 r/min，发酵60 h和72 h产酶并无明显差异。故采用60 h发酵，转速225 r/min较适宜。

图7 不同转速对产β-甘露聚糖酶的影响

3 结论

本文采用毕赤酵母组成型工程菌株M27-8进行高密度发酵，优化培养基配比及培养条件，得出最佳产酶条件。优化后基本培养基组成为6%的玉米浆干粉作为氮源，3%的葡萄糖作为碳源，较采用优化前的YPD培养基价格低廉，适宜规模化生产；优化后基本培养参数采用发酵pH为5.5，培养时间60 h，接种量2%，发酵温度不超过28℃，转速225 r/min，能够达到最佳的产酶条件，最大酶活达到452.7 U/mL，是优化前酶活138 U/mL的3.3倍。

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The optimal conditions for the production of β-manganese were obtained by using Pichia pastors engineering strain M27-8.The content nitrogen sources，glucose content，pH，fermentation time，inoculum size，temperature and speed were optimized.The results showed that the optimum conditions for enzyme production were as follows：6%corn steep liquor，3%glucose，pH 5.5，fermentation 60 h，2%inoculation amount，28 ℃，225 r/min，the maximum activity reached 452.7 U/mL，which was 3.3 times of that of the optimized enzyme activity of 138 U/mL.In conclusion，substitution of YPD medium with cheaper corn pulp medium could save costs and lay the foundations for industrial production.

β-mannanase；Pichia pastoris；fermentation conditions；optimization

S816.3

A

1004-3314（2017）19-0013-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20171903

广州市科技计划项目（201710010154）

*通讯作者