血管生成素2与抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎活动的关系

张凤霞+徐瑞权

[摘要] 目的 本研究旨在探讨血管生成素2（angiopoietin-2，Ang2）与抗中性粒细胞胞浆抗体（anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）相关性血管炎（ANCA-associated vasculitis，AAV）活动的关系。 方法 本研究纳入2012年5月～2016年5月间在我院住院的AAV患者共52例，所有AAV患者行伯明翰系统性血管炎活动评分（BVAS），选取BVAS<3分为非活动组，BVAS≥3分为活动组，选取我院同期健康体检者20名作为健康对照组。收集AAV患者血清，检测Ang2、血沉（ESR）、C反應蛋白（CRP）、循环内皮细胞（CECs）等，对Ang2 水平与血清学指标进行相关性分析。用特征性曲线（ROC）及曲线下面积（AUC）对Ang2、CRP 及 ESR 区分活动期及非活动期的准确度进行评价。 结果 活动组患者的血Ang2、ESR、CRP、CECs 及 BVAS 评分较非活动组患者明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。Ang2 水平与24 h 尿总蛋白（r=0.461，P<0.05）、BVAS（r=0.745，P<0.05）、CECs（r=0.657，P<0.05）分别呈正相关。ROC 分析显示 Ang2 的曲线下面积明显高于CRP和ESR，用外周血 Ang2 的浓度来区分 AAV 患者的非活动组与活动组准确度明显高于 ESR 和 CRP（P<0.05）。 结论 Ang2 不仅可以作为ANCA相关性血管炎活动性的指标，还有望成为一些内皮细胞疾病的靶向治疗药物。

[关键词] 血管生成素2；抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎；活动性；循环内皮细胞

[中图分类号] R446.11 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）25-0015-04

The relationship between angiopoietin-2 and anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis activity

ZHANG Fengxia1 XU Ruiquan2

1.Department of Nephrology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou 341000，China；2.Department of Urology，the First Affiliated Hospital of Gannan Medical University，Ganzhou 341000， China

[Abstract] Objective To investigate the relationship between angiopoietin-2（Ang2） and anti-neutrophil cytoplasmic antibodies（ANCA） ANCA-associated vasculitis（AAV） activity. Methods A total of 52 AAV patients who were hospitalized in our hospital from May 2012 to May 2016 were enrolled in the study. All AAV patients were given Birmingham systemic vasculitis activity score（BVAS）. The patients with BVAS<3 were divided into the non-active group， and the patients with BVAS≥3 were divided into the active group. 20 healthy volunteers who received physical examination in our hospital were selected as the healthy control group. The serum of AAV patients was collected， and Ang2， ESR， C-reactive protein（CRP）， circulating endothelial cells（CECs） were detected. Correlation analysis was carried out on Ang2 level and serological parameters. The accuracy of Ang2， CRP and ESR in differentiating the active and non-active phases was evaluated by the ROC and AUC. Results The levels of Ang2， ESR， CRP， CECs and BVAS scores in the active group were significantly higher than those in the non-active group， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Ang2 level was correlated with 24 h urinary total protein（r=0.461， P<0.05）， BVAS（r=0.745，P<0.05） and CECs（r=0.657，P<0.05）. ROC analysis showed that the AUC of Ang2 was significantly higher than CRP and ESR. The accuracy of the concentration of Ang2 in peripheral blood in differentiating the active and non-active group was significantly higher than that in ESR and CRP in AAV patients（P<0.05）. Conclusion Ang2 can not only serve as an indicator of the activity of ANCA-associated vasculitis， but also is expected to be the drug of targeted therapy for some endothelial cell diseases.endprint

[Key words] Angiopoietin-2（Ang2）； ANCA-associated vasculitis（AAV）； Activity； Circulating endothelial cells（CECs）

抗中性粒细胞胞浆抗体（anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA）相关性系统性血管炎（ANCA-associated vasculitis，AAV）是一组累及中、小血管的抗中性粒细胞胞浆抗体阳性的自身免疫性疾病。ANCA相关性血管炎近年发病率逐年攀升，且迄今缺乏早期诊断及特效治疗的方法[1]。因此，探寻早期诊断指标具有重要意义。血管生成素2（angiopoietin-2，Ang2）是人体重要的血管特异性酪氨酸激酶感受器，对血管的稳定起着重要的作用。研究表明 Ang2 可促进血管内皮细胞的凋亡[2]。本文对 Ang2 与 ANCA 相关性血管炎活动的相关性进行分析，旨在探讨Ang2在ANCA 相关性血管炎活动性评价中的意义。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2012年5月～2016年5月间在我院肾内科住院的AAV患者共52例。纳入标准：（1）确诊为AAV，诊断标准参照1994年美国Chapel Hill会议关于系统血管炎命名分类法及美国风湿病学会的分类标准[3]。（2）合并慢性肾脏病：①肾损害病程超过3个月，表现为不同程度的蛋白尿、血尿，无论有无肾功能的下降；②肾小球滤过率（GFR）<60 mL/（min·1.73 m2）持续超过3个月，无论有无肾损害表现。（3）血清ANCA阳性。排除标准：合并严重感染；合并恶性肿瘤疾病；其他自身免疫性疾病（包括系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、硬皮病、皮肌炎、混合性结缔组织病等）。其中男34例，女18例，平均年龄（61.10±13.75）岁。采用伯明翰系统性血管炎活动评分（BVAS）计算活动性评分，非活动组21例（BVAS评分<3分），活动组31例（BVAS评分≥3分）。另选取我院健康体检者20例为对照组，其中男10例，女10例，平均年龄（60.50±12.79）岁，无相关免疫性疾病。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 在治疗之前，清晨空腹采集外周血，注入含枸橼酸钠的抗凝管中，混匀后用离心半径为10 cm 的离心机2000 r/min 离心10 min，分离血清，取上清分装Eppendorf 管，置入-80℃冰箱冷藏。

1.2.2 相关指标的测定 采用全自动生化分析仪测定ESR、CRP、血肌酐、血分析、C3水平，收集并测量24 h 尿蛋白定量（均由赣南医学院第一附属医院检验科进行操作完成）。

1.2.3 Ang2的测定 运用ELISA检测血清中的Ang2，ELISA kit由R&D公司提供，操作按说明书。

1.2.4 CECs的测定 采用免疫磁珠分离方法检测[4]。具体方法：抽取外周血2 mL，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝。洗涤M-450 磁珠（Dynal，Hamburg，Germany），将稀释后的抗CD-146 单抗（Biocytex，Marseilles，France）包被在磁珠表面，4℃孵育30 min，PBS洗涤后，用小牛血清封闭10 min，再次经PBS洗涤后，加入1 mL EDTA抗凝全血，混匀后，4℃孵育30 min，PBS洗涤后，用100 μL PBS悬浮磁珠，最后在显微镜下用细胞计数板计数，单位为（个/mL）。内皮细胞的鉴定标准：（1）细胞形态：较大体积的圆形或椭圆型细胞（直径10～50 μm）；（2）必须和4个以上磁珠结合。

1.2.5 对所有样本予BVAS 评价ANCA相关性血管炎活动性最常用的方法是伯明翰血管炎活动性评分（BVAS 1994）量表法[5]，通过一般情况、皮肤黏膜、耳鼻喉、胸部、心血管、腹部、肾脏、神经系统9大系统71项条目评价血管炎的活动性。选取BVAS<3分为非活动组，BVAS≥3分为活动组。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0软件进行统计学分析，计数资料采用χ2检验，计量资料用均数±标准差表示，三组间比较用方差分析，分别将Ang2水平与BVAS相关性分析用 Pearson 相关性分析。用特征性曲线（ROC）及曲线下面积（AUC）对Ang2、CRP及ESR区分活动期及非活动期的准确度進行评价。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组临床资料比较

活动组患者血Ang2、血沉、C反应蛋白、CECs、血沉及BVAS明显较非活动组患者明显升高，差异有统计学意义（P<0.05），其余各项基本临床特征方面比较无显著性差异（P>0.05）。见表1。

2.2 AAV患者Ang2与各项临床检验项目的相关性分析

Ang2 水平与24 h 尿总蛋白（r=0.461，P<0.05）、BVAS（r=0.745，P<0.05）、CECs（r=0.657，P<0.05）分别呈正相关。见图1。

2.3 AAV患者在非活动组和活动组Ang2、CRP、ESR的ROC曲线分析

Ang2区分非活动组与活动组AAV患者的曲线下面积为0.976，P<0.001，95%置信区间（0.943～1.000）；ESR区分非活动组与活动组AAV患者曲线下面积为0.698，P=0.016，95%置信区间（0.555～0.841）；CRP区分非活动组与活动组AAV患者曲线下面积为0.769，P=0.001，95%置信区间（0.628～0.910）。Ang2作ROC曲线，得出约登指数最大值为0.873，即以Ang2=574 ng/L时，其灵敏度和特异度分别为96.8%和90.5%。Ang2的曲线下面积明显高于CRP和ESR（P<0.01），提示用外周血Ang2的浓度来区分AAV患者的非活动组与活动组准确度明显高于ESR和CRP。见封三图2。endprint

3 讨论

ANCA介导的中性粒细胞与内皮细胞的损伤是ANCA相关性血管炎的重要发病机制[6]。ANCA激活中性粒细胞导致血管壁的粘连、渗透脆性改变及血管内皮的损坏[7]。被损害的内皮细胞失去与周围细胞或细胞外基质的连接，使内皮细胞与基底膜分离并释放至外周血中[8]，外周血中的循环内皮细胞（CECs）数量增加。因此，我们可以通过计算外周血中的循环内皮细胞来衡量血管的损害[9]，并可作为评价疾病活动的量化指标。目前，评价ANCA相关性血管炎活动性最常用的方法是伯明翰血管炎活动性评分（BVAS 1994）量表法[5]。另外，临床上血沉（ESR）、C反应蛋白（CRP）也是较为常用的血管炎性活动性评价指标[10]。但上述方法均有一定的局限性，尤其不能在疾病的早期准确地评价其活动度及临床疗效。

本研究检测了AAV患者外周血中活动组患者血Ang2、ESR、CRP及BVAS明显较非活动组患者明显升高，标志着Ang2与ESR、CRP、BVAS一样，可用来区别AAV患者是否活动。24 h 尿总蛋白不仅是多种全身性疾病早期肾损害的敏感指标，而且是病情演变和疗效判断的重要指标。本研究通过相关性分析发现AAV患者血清Ang2水平与24 h尿总蛋白呈正相关，且 Ang2 水平与 BVAS、CECs 也分别呈正相关。用外周血 Ang2 的浓度来区分 AAV 患者的活动组和非活动组准确度明显高于 ESR 和 CRP，Ang2 作为临床评价ANCA 相关性血管炎活动性指标具有明显优势。

Woywodt A等[11]在2003年研究报道了ANCA相关性血管炎患者外周血循环内皮细胞的数量，发现循环内皮细胞数目与疾病的活动性相关，在疾病活动期循环内皮细胞的数量明显增多，而静止期患者循环内皮细胞的数量减少，与本研究的结论一致。本研究显示，Ang2与CECs数有明显的相关性。本文不能说Ang2的浓度可直接影响到CECs数目，但大量临床实验己经证实Ang2与Tie2受体结合可以使内皮细胞失去屏障功能，导致内皮细胞分离[12]。因此，循环Ang2与CECs有相同的价值，本文猜测循环Ang2能够减少内皮细胞的固着，导致内皮细胞分离致外周血中。Ang2的检测比CECs更方便，因此，Ang2是评估内皮细胞活动的一个既方便又准确的方法[13]。

研究表明[14]，Ang2影响内皮细胞的稳定，使内皮细胞接受外源性刺激从而促进炎症因子（腫瘤坏死因子和白细胞介素-1）和血管因子（血管内皮生长因子）活动。Ang2储存在WP小体（Weibel-Palade）中，在受到刺激后快速释放，与Ang-Tie2结合，从而促进血管的炎症反应及内皮细胞的分离。Ang2在静止的内皮细胞中表达很弱，而在活动的内皮细胞中表达很强[2]。

到目前为止，在很多实验中己经被证实Ang2可以用于某些疾病的治疗[15]。Ang2在评估AAV患者的准确度上高于传统标志物CRP及ESR。Ang2 不仅可能作为一种新的监测 ANCA相关性血管炎活动性的指标，还有望成为一些患者内皮细胞疾病的靶向治疗药物。

[参考文献]

[1] Bosch X，Guilabert A，Espinosa G，et al. Immunotherapy for antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis： challenging the therapeutic status quo？[J].Trends Immunol，2008，29（6）：280-289.

[2] Fiedler U，Augustin HG. Angiopoietins：A link between angiogenesis and inflammation[J]. Trends Immunol，2006， 27（12）：552-558.

[3] Jennette JC，Falk RJ，Andrassy K，et al. Nomenclature of systemic vasculitides. Proposal of an international consensus conference[J].Arthritis Rheum，1994，37（2）：187-192.

[4] De Groot K，Goldberg C，Bahlmann FH. Vascular endothelial damage and repair in antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis[J]. Arthritis Rheum，2007，56（11）：3847-3853.

[5] Gregorini M，Maccario R，Avanzini MA，et al. Antineutrophil cytoplasmic antibody-associated renal vasculitis treated with autologous mesenchymal stromal cells：Evaluation of the contribution of immune-mediated mechanisms[J]. Mayo Clin Proc，2013，88（10）：1174-1179.

[6] Little MA，Savage CO. The role of the endothelium in systemic small vessel vasculitis[J]. Clin Exp Rheumatol，2008，（3 Suppl 49）：S135-S140.

[7] Badakere SS，Pradhan VD，Almeida AF，et al. Use of immunofluorescence and confocal laser scanning microscopy in identifying rare cases of anti-neutrophil cytoplasmic antibodies（ANCA） showing dual specificities to myeloperoxidase and proteinase3[J].Fluoresc，2004，14（4）：459-463.endprint

[8] Woywodt A，，Bahlmann FH，De Groot K，et al. Circulating endothelial cells：Life，death， detachment and repair of the endothelial cell layer[J]. Nephrol Dial Transplant，2002，17（10）： 1728-1730.

[9] Le Roux S，Pepper RJ，Dufay A. Elevated soluble Flt1 inhibits endothelial repair in PR3-ANCA-associated vasculitis[J]. J Am Soc Nephrol，2012，23（1）：155-164.

[10] Mukhtyar C，Lee R，Brown D，et al. Modification and validation of the Birmingham vasculitis activity score（version 3）[J]. Ann Rheum Dis，2009，68（12）：1827-1832.

[11] Woywodt A，Streiber F，De Groot K，et al.Circulating endothelial cells as markers for ANCA-associated small-vessel vasculitis[J]. Lancet，2003，361（9353）：206-210.

[12] Bontscho J，Schreiber A，Manz RA，et al. Myeloperoxidase-specific plasma cell depletion by bortezomib protects from anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies-induced glomerulonephritis[J]. J Am Soc Nephrol，2011， 22（2）：336-348.

[13] Lukasz A，Hellpap J，Horn R，et al. Circulating angiopoietin-1 and angiopoietin-2 in critically ill patients：Development and clinical application of two new immunoassays[J]. Crit Care，2008，12 （4）：R94.

[14] Fiedler U，Reiss Y，Scharpfenecker M，et al. Angiopoietin-2 sensitizes endothelial cells to TNF-alpha and has a crucial role in the induction of inflammation[J]. Nat Med，2006，12 （2）： 235-239.

[15] Tressel SL，Kim H，Ni CW，et al. Angiopoietin-2 stimulates blood flow recovery after femoral artery occlusion by inducing inflammation and arteriogenesis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28（11）：1989-1995.endprint