青海蚕豆中原花青素和左旋多巴的含量测定和品种间差异的比较

申士富，钱 静，刘 廷，李俊松，赵永贵，狄留庆

(1南京中医药大学药学院，南京 210046； 2江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心，南京 210046；3青海源兴工贸有限公司，西宁 810000)

青海蚕豆中原花青素和左旋多巴的含量测定和品种间差异的比较

申士富1，2，钱 静1，2，刘 廷1，2，李俊松1，2，赵永贵3，狄留庆1，2

(1南京中医药大学药学院，南京 210046；2江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心，南京 210046；3青海源兴工贸有限公司，西宁 810000)

目的：建立青海蚕豆中左旋多巴和原花青素含量测定方法，测量22批样品的含量。方法：采用紫外分光光度法测量原花青素的含量，检测波长为554nm。采用HPLC法检测蚕豆中L-多巴含量：色谱柱：汉邦ODS-2(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：甲醇-0.1mol/L冰醋酸溶液(5∶95)；流速：0.8 mL/min；测定波长：280 nm；柱温：25/3℃；进样量：20μL。结果：原花青素在75～375μg/mL范围内线性良好、L-多巴在75～375μg/mL范围内线性良好。结论：青海蚕豆中左旋多巴和原花青素含量测定方法稳定可靠。

青海蚕豆；左旋多巴；原花青素；紫外分光光度法；HPLC

青海蚕豆由于地产青海省，海拔高，有籽粒大而饱满、颜色乳白、无虫(豆象)的特点，被国际市场公认为世界上最好的蚕豆之一[1]。研究表明，蚕豆中含有的原花青素(OPC)具有抗氧化、抑菌、抗癌和抗突变等生理活性[2]。青海蚕豆因其含有左旋多巴(L-DOPA)而被用作治疗帕金森症、高血压、肾功能衰竭和肝硬化的膳食补充剂。本文采用UV、HPLC等分析方法分别测定青海蚕豆中原花青素、左旋多巴的含量，对开展青海蚕豆的品质评价及等级区分具有重要的应用价值。

1 仪器试剂

TU-1810型紫外分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；美国Waters e2695高效液相色谱系统(2998 PDA检测器)；汉邦ODS-2(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱；Anke TGL-16C高速离心机(上海安亭科学仪器厂)；电子分析天平(BP211D型德国Satrorius公司，FA1204B上海精密科学有限公司)；Milli-Q Synthesis 108超纯水仪(美国密理博公司)；数控超声波清洗器(KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司)。

试药与试剂：乙醇(分析纯，南京化学试剂股份有限公司，批号150827677E)；甲醇(色谱纯，江苏汉邦科技有限公司)；乙酸(分析纯，国药化学试剂有限公司)；盐酸(分析纯，扬州沪宝化学试剂有限公司)；左旋多巴(中国食品药品检定研究院，批号：100170-200303)；正丁醇(江苏强盛功能化学股份有限公司，批号20140102)；十二水硫酸铁铵(国药集团化学试剂有限公司，批号20141014)。青海12号蚕豆、13号蚕豆以及马牙蚕豆，均由青海源兴工贸有限公司提供，样品来源信息见表1。

2 结果与方法

2.1 不同品种蚕豆的皮及子叶中原花青素类物质的含量测定

2.1.1供试品溶液的制备 取蚕豆皮粉1g，精密称定，置于锥形瓶中，加50mL 50%乙醇溶液，称重，60℃水浴1h，待冷却后补足失重，离心(6 000r/min，7min)取上清即为供试品溶液[3]。

2.1.2对照品溶液的制备 取原花青素对照品适量，精密称定，加50%乙醇制成0.994 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3检测波长的选择 分别精密吸取供试品溶液及适宜浓度的对照品溶液2mL，加入5%盐酸正丁醇溶液15mL及2%硫酸铁铵溶液0.5 mL，100±2℃水浴加热40 min，冷却后于190～800 nm波长范围内测定，波长选择为554nm(图1、图2)。

表1 青海蚕豆品种及产地信息

图1 原花青素紫外吸收光谱图

图2 供试品紫外吸收光谱图

2.1.4线性关系考察 配制系列浓度原花青素对照品溶液(75、150、225、300、375μg/mL)，按2.1.3项下方法显色，以2.1.1项下空白溶液作对照，在554nm处测定吸光度(A)值，得原花青素A值对质量浓度的回归方程Y=0.002 3X+0.006 1，r=0.999 1，结果表明，原花青素在75～375μg/mL范围内线性良好。

2.1.5精密度考察

取原花青素对照品溶液(225μg/mL)按2.1.3项下方法显色，以2.1.1项下空白溶液作对照，在554 nm处测定吸光度(A)值，连续测定6次，结果RSD为1.67%。

2.1.6重复性试验 取蚕豆皮粉样品(湟源县和平乡和平村)，按2.1.1项下方法制备供试品溶液6份，用50%乙醇稀释2倍后按2.1.3项下方法显色，以2.1.1项下空白溶液作对照，在554 nm处测定吸光度(A)值，结果其平均含量为18.74 mg/g，RSD为1.43%。

2.1.7稳定性试验 取蚕豆皮粉样品，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，用50%乙醇稀释2倍后按2.1.3项下方法显色，以2.1.1项下空白溶液作对照，分别于0、5、10、15、20、30、40、60 min时在554 nm处测定吸光度(A)，RSD为2.53%。

2.1.8加样回收率试验 取蚕豆皮粉样品，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，用50%乙醇稀释2倍，与225μg/mL原花青素对照品溶液按体积比1∶1混合，制备6份供试品溶液，按2.1.3项下方法显色，以2.1.1项下空白溶液作对照，在554 nm处测定吸光度(A)值，回收率在97.58%～101.37%之间，RSD为1.50%(表2)。

表2 原花青素加样回收率结果

2.1.9结果 青海蚕豆中原花青素含量测定结果见表3。

2.2 不同品种蚕豆中左旋多巴的含量测定

2.2.1色谱条件[4]色谱柱：汉邦ODS-2(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相：甲醇-0.1mol/L冰醋酸溶液(5∶95)；流速：0.8 mL/min；测定波长：280 nm；柱温：25℃；进样量：20μL。

2.2.2提取方法考察 取青海蚕豆粉末(互助县东山乡)0.5g，精密称定，加入酸性乙醇20mL，分别采用回流加热1h、超声提取1h以及冷浸法提取24 h，再于4 000r/min离心10 min，取上清液5.0 mL于蒸发皿中60℃水浴上挥干，加入0.1mol/mL的HAc溶液(含有0.05%L-半胱氨酸作为抗氧剂)复溶，定容至2mL，经14 000 r/min离心7 min，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

按2.5.1项下色谱条件进样，测定，结果冷浸、回流、超声所得分别为442.12、924.56、241.81峰面积均值/mg(n=3)，回流提取的左旋多巴含量最高，因此，选择加热回流提取[5]。

表3 青海蚕豆中原花青素含量测定结果(n=3)

2.2.3提取溶剂考察 取经打粉后的蚕豆粉末0.5g，精密称定，分别加入盐酸乙醇溶液、醋酸乙醇溶液、盐酸溶液和醋酸溶液各20mL，回流加热1h后，再于4 000 r/min离心10 min，取上清液5.0 mL于蒸发皿中60℃水浴上挥干，加入0.1mol/mL的HAc溶液(含有0.05%L-半胱氨酸作为抗氧剂)复溶，定容至2mL，经14 000 r/min离心7 min，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，即得[5]。

按2.2.1项下色谱条件进样，每种提取方式制备3份，记录左旋多巴峰面积，按每mg样品量计算面积值，结果分别为834.0、285.8、287.7、197.6峰面积均值/mg(n=3)。盐酸乙醇溶液提取的左旋多巴含量最高，因此，选择盐酸乙醇溶液。

2.2.4提取时间考察 取经打粉后的蚕豆粉末0.5g，精密称定，加入盐酸乙醇溶液20mL，分别回流加热0.5、1、1.5h后，再于4 000 r/min离心10 min，取上清液5.0 mL于蒸发皿中60℃水浴上挥干，加入0.1mol/mL的HAc溶液复溶(含有0.05%L-半胱氨酸作为抗氧剂)，定容至2mL，经14 000 r/min离心7 min，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得[5]。

按2.5.1项下色谱条件进样，测定，记录左旋多巴峰面积，按每mg样品量计算面积值，结果分别为817.5、924.6、573.4峰面积均值/mg(n=3)，提取时间为1h的左旋多巴含量最高。

2.2.5供试品溶液制备 取经打粉后的蚕豆粉末0.5g，精密称定，加入盐酸乙醇溶液(9mL盐酸加85%乙醇至1 000mL)20mL，回流加热1h后，再于4 000 r/min离心10 min，取上清液5.0 mL于蒸发皿中60℃水浴上挥干，加入0.1mol/mL的HAc溶液复溶(含有0.05%L-半胱氨酸作为抗氧剂)，定容至2mL，经14 000r/min离心7 min，用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.6对照品溶液的制备及空白溶液的制备 精密称取左旋多巴对照品适量，加盐酸溶液配成每1mL含405.8μg的溶液，作为对照品贮备液。取0.1mol/mL的HAc溶液溶液(含有0.05%L-半胱氨酸作为抗氧剂)10mL，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为空白对照液。

图3 对照品溶液(A)、空白溶液(B)、供试品溶液(C)

2.2.7方法学考察 (1)系统适应性试验及专属性考察 按照“ 2.2.1”项下色谱条件，分别量取 “2.2.5”及“2.2.6”项下溶液各20 μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，详见图3。结果，对照品与样品溶液主峰的保留时间一致，空白溶液在左旋多巴相应位置处无色谱峰出现，不干扰左旋多巴的含量测定。理论塔板数以左旋多巴峰计算不低于2 000。(2)精密度试验：取同一份标准品溶液，重复进样6次，记录所测各组分峰面积，结果左旋多巴色谱峰面积的RSD(n=6)为0.16%，仪器精密度良好。(3)线性试验：精密吸取405.8μg/mL的左旋多巴对照品溶液适量，依次稀释1、2、4、8、16、32、64、128倍，过0.45μm滤膜，分别吸取20μL，用高效液相色谱，依法测定，以对照品浓度X(μg/mL)为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。左旋多巴的线性方程为Y=19 618X+7 753.3，线性范围为3.17～405.8μg/mL，r =0.999 9。(4)重复性试验：取湟源县申中乡申中村马牙蚕豆，按2.2.5供试品溶液制备方法，制备5份，进样，测定。结果表明，左旋多巴平均含量为292.00μg/g，RSD(n=5)为2.80%，表明重复性良好。(5)稳定性试验：取同一份供试品溶液，进样20μL，分别在0、2、4、6、12、24h进样1次，记录所测成分峰面积。结果左旋多巴色谱峰峰面积的RSD(n=6)为0.69%，表明供试品溶液在24h内稳定。(6)加样回收试验：取已知含量样品蚕豆粉 6份，每份约2.5g，精密称定，加入左旋多巴对照品64.93mg，按照“2.5.4”项下制备供试品溶液。结果左旋多巴的平均加样回收率为99.15%(n=6)，RSD为2.41%，表明具有良好的准确性(表4)。

表4 加样回收试验

2.2.8样品含量测定 取9批样品，按2.2.5项下方法制备，依法进样测定，结果见表5。

表5 各产地蚕豆中左旋多巴含量测定结果(n=3)

3 结果与讨论

(1)原花青素测定结果表明，三个品种的蚕豆原花青素含量均值由高到低分别为青海13号22.77mg/g、青海12号22.23mg/g、马牙蚕豆20.05mg/g，差距不大。互助县西山乡的蚕豆原花青素的含量较高为28.15 mg/g，大通县塔儿沟镇塔儿沟村的蚕豆原花青素含量最低为17.95mg/g。(2)左旋多巴测定结果表明，青海13号320.7μg/g>青海12号332.03μg/g>马牙蚕豆263.41μg/g，20批样品中左旋多巴的含量在115.3～533.81μg/g。大通县塔儿沟镇塔儿沟村的蚕豆左旋多巴含量最低为115.3μg/g，互助县西山乡的蚕豆左旋多巴含量最高为533.81μg/g。(3)蚕豆皮中含有丰富的左旋多巴，但目前，我国蚕豆在加工过程中有豆皮、豆荚等副产物，一般都不能加以利用[7]。另外，目前常采用炒焙、油炸等加工方式，大多经过高温。文献报道左旋多巴不稳定，易氧化，故测了加工后的左旋多巴的含量。取加工(煮熟取蚕豆皮、去皮的蚕豆、带皮蚕豆)和未加工的申中乡申中村马牙蚕豆适量进行测定，含量分别为生蚕豆(去皮)115.94μg/g、熟蚕豆(去皮)44.47μg/g、生蚕豆皮208.95μg/g、熟蚕豆皮41.48μg/g、生蚕豆292.00μg/g、熟蚕豆52.89μg/g。结果表明，左旋多巴高温下明显不稳定。(4)在考察左旋多巴稳定性的实验中左旋多巴含量下降较快。文献报道L-DOPA具有较强的还原性，在空气中变黑，是导致左旋多巴含量下降的原因。因此加入抗氧化剂。(5)蚕豆皮中左旋多巴和原花青素的含量较丰富。样品中原花青素的含量14.92～28.15 mg/g，左旋多巴的含量在115.3～550.13μg/g，与相关文献中的结果一致[6]。对于蚕豆的质量标准的建立和进一步开发利用提供依据。◇

[1]胡军.左旋多巴的植物资源[J]. 中国野生植物，1987(3)：25-29.

[2]张宏.蚕豆皮原花青素制备及其抗氧化活性研究[D]. 武汉工业学院，2012.

[3]郑开斌，李爱萍，曹奕鸯，等.蚕豆花左旋多巴液相色谱检测方法的建立[J]. 江苏农业学报，2012，28(3)：688-690.

[4]曹奕鸯.蚕豆左旋多巴(L-DOPA)含量的研究[D].福建农林大学，2010.

[5]宋江峰，李大婧，刘春泉.发芽蚕豆左旋多巴超声强化提取及其动力学过程[J]. 农业工程学报，2012(19)：248-254.

[6]Ben-Shlomo Y，Marmot MG.Survival and cause of death in a cohort of patients with parkinsonism：possible clues to aetiology[J]. Neurol Neurosurg Psychiatry，1995，58(37)：293-299.

[7]傅翠真，李安智，张丰德，等.食用豆种质资源品质鉴定及营养特性[J]. 中国农业科学，1994(5)：33-38.

Determination of Oligomeric Proanthocyanidins and Levodopa in Broad Bean from Qinghai Province and Comparison of Differences Among Varieties

SHEN Shi-fu1，2，QIAN Jing1，2，LIU Ting1，2，LI Jun-song1，2, ZHAO Yong-gui3,DI Liu-qing1，2

(1College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China;2Jiangsu Engineering Research Center for Efficient Delivery System of Chinese Materia Medica，Nanjing 210046，China;3Qinghai Yuanxing Industry & Trade Co.，Ltd.，Xining 810000,China)

【Objective】 To establish a method for determination of levodopa and oligomeric proanthocyanidins (OPC)content for measuring 22 batches of samples.【Method】 Detection wavelength of UV spectrophotometric method for OPC was 554nm.HPLC method was established to detect the content of L-dopa in broad bean：column：hanbon ODS-2 (250mm * 4.6mm，5 μm)，mobile phase：methanol -0.1mol/L acetic acid solution (5∶95)；flow rate 0.8 mL/min；detection wavelength 280 nm；column temperature 25℃；sample size 20μL.【Result】 The results showed that the range of 75～375μg/mL was good linear for OPC and L-DOPA.【Conclusion】 The two methods were stable and reliable.The content of the 20 batches of samples were determined，and the changes of the content before and after processing were compared.

broad bean；levodopa(L-DOPA)；oligomeric proanthocyanidin(OPC)；Ultraviolet Spectrophotometry；HPLC

江苏省重点研发专项资金项目(项目编号：BF2016004)；青海省星火计划项目(项目编号：2014-NS-306)；江苏高校优势学科建设工程资助项目(项目编号：PAPD)；江苏省“青蓝工程”创新团队支持计划资助(项目编号：QLP)。

申士富(1991— )，男，在读硕士，研究方向：中药药剂学。

狄留庆(1964— )，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：中药药剂学。

(责任编辑 唐建敏)