高效液相色谱法测定白灵菇中荧光增白剂含量

张春芳 曹秀梅 佟 琦* 杨卫军 张嘉楠 杨赵伟

(1 河北省应用化学重点实验室 燕山大学环境与化学工程学院，河北 秦皇岛 066004；2 秦皇岛市农产品质量安全监督检验中心，河北 秦皇岛 066004)

高效液相色谱法测定白灵菇中荧光增白剂含量

张春芳1曹秀梅2佟 琦1*杨卫军2张嘉楠2杨赵伟2

(1 河北省应用化学重点实验室 燕山大学环境与化学工程学院，河北 秦皇岛 066004；2 秦皇岛市农产品质量安全监督检验中心，河北 秦皇岛 066004)

建立了用高效液相色谱法同时测定白灵菇中3种荧光增白剂(VBL、CBS、CXT)的方法。试样用乙醇-水(V/V=1/2)溶液作提取剂，50 ℃条件下水浴静置提取15 min。采用C18(250 mm×4.6 mm，2.6 μm)为分析柱，以乙酸铵(20 mmol/L)+乙腈[65+35]为流动相洗脱，流速为0.8 mL/min。3种荧光增白剂在0.01～10 μg/mL范围内线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.997；加标回收率为79%～90%。方法简单准确，线性关系、重现性及加标回收率均满足分析要求。

白灵菇；荧光增白剂；高效液相色谱

前言

国家食品安全整顿办发布的(2010)50号文件中，将荧光增白物质列入第四批“食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂”黑名单中。同时公布可能添加的食品品种有双孢蘑菇、金针菇、白灵菇等[1]。其中，白灵菇又名雪山灵芝，营养丰富，含有氨基酸、无机盐及维生素等，具有调节生理平衡、增强免疫力作用。

荧光增白剂除具有较好的增白作用外，还具有一定的保鲜、防腐功能，并非可食用型食品添加剂，严禁违法添加到食品中。目前，荧光增白剂检测方法主要有紫外光灯照射法，紫外分光光度法[2]，荧光分光光度法[3-4]，高效液相色谱法[5-9]及液相色谱-质谱串联法[10-13]等。

本研究采用高效液相色谱分析方法，以市面上最容易购买、价格低廉、增白效果明显且常被检出于其它样品中的三种具有离解性质的阴离子型荧光增白剂VBL、CBS、CXT为检测对象，以乙醇-水为提取溶剂，恒温水浴静置提取白灵菇中三种荧光增白剂，操作简单，可行性较好，并应用该方法研究了白灵菇中荧光增白剂的提取条件。

1 实验部分

1.1仪器、试剂与材料

UltiMate 3000液相色谱(美国Thermo Fisher科技公司)、FA2104型电子天平、恒温水浴箱，乙腈、甲醇(HPLC级)、乙酸铵(分析纯)、无水乙醇(分析纯)、荧光增白剂VBL(纯度98%)、荧光增白剂CBS(纯度99%)、荧光增白剂CXT(纯度99%)，实验用水为超纯水，实验用白灵菇购买于秦皇岛市蔬菜市场，自制阳性样品。

1.2标准溶液配制

准确称取0.100 0 g荧光增白剂，用乙醇-水(V/V=1/2)溶液溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成1.0 g/L的标准储备溶液，于4 ℃冰箱中避光保存，备用。

1.3样品前处理

称取待测白灵菇样品5.00 g于50 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL乙醇-水(V/V=1/2)溶液，50 ℃水浴静置提取15 min，流水冷至室温。取上述溶液过0.22 μm水相滤膜，供液相色谱仪测定。

1.4液相色谱条件

采用Thermo Fisher Accucore C18(250 mm×4.6 mm，2.6 μm)色谱柱；用乙酸铵(20 mmol/L)和乙腈作流动相，V(乙酸铵)∶V(乙腈)=65∶35；流速0.8 mL/min；激发波长350 nm，发射波长430 nm；进样量10 μL；柱温30 ℃。

2 结果与讨论

2.1色谱图

在最佳液相色谱运行条件下，3种荧光增白剂混合标准溶液的分离色谱图见图1。

图1 3种荧光增白剂混合标准溶液的色谱图Figure 1 Chromatogram of a standard mixture of the three FWAs.

2.2提取方式选择

实验采用水浴静置、超声波和空气振荡三种方式对白灵菇中3种荧光增白剂的提取效果进行比较，其中水浴静置提取效果较好。三种提取方式比较见图2。

图2 三种提取方式比较图Figure 2 Comparison of three extraction methods.

2.3提取时间和温度的选择

称取阳性白灵菇试样5.00 g于50 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL乙醇-水(V/V=1/2)溶液，50 ℃水浴静置提取，探讨不同提取时间(10、15、20、25 min)对白灵菇中3种荧光增白剂提取的影响。时间为15 min时达到最佳提取效果，15 min后随着时间的延长，试样中其它基质不断析出，对目标物质造成影响。不同提取时间对3种荧光增白剂的影响见图3。

图3 时间对3种荧光增白剂的影响Figure 3 Effects of extraction times on three FWAs.

称取阳性白灵菇试样5.00 g于50 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL乙醇-水(V/V=1/2)溶液，分别于不同温度(30、40、50、60 ℃)下水浴静置提取15 min，探讨最佳提取温度。结果表明：温度为50 ℃时提取效果最佳。提取温度对3种荧光增白剂提取结果影响见图4。

图4 温度对3种荧光增白剂的影响Figure 4 Effects of extraction temperatures on three FWAs.

2.4提取剂的选择

保持其它条件不变，配制不同比例的乙醇:水溶液(V∶V=1/2、1/4、1/6及1/8，mL/mL)，反复实验，当V乙醇∶V水=1∶2时，效果最佳。不同比例乙醇水溶液对3种荧光增白剂提取见图5。

图5 乙醇-水溶液对3种荧光增白剂的提取量Figure 5 Extraction amount of three FWAs with ethanol containing different concentration water.

2.5固液比的选择

保持其它条件不变，不同固液比(5∶10、5∶20、5∶25、5∶30，g/mL)条件下提取，提取液分别定容于50 mL容量瓶中。当固液比为5∶20时，提取效果最佳。固液比例对3种荧光增白剂提取影响结果见图6。

图6 提取溶剂体积对3种荧光 增白剂的影响Figure 6 Effects of extraction solvent volumes on three FWAs.

2.6工作曲线和检出限

适量移取三种荧光增白剂标准储备溶液，配成荧光增白剂混合标准溶液，逐级稀释，以荧光增白剂的色谱峰面积为纵坐标y(counts)，对应的浓度为横坐标x(μg/mL)，进行线性回归。得到3种荧光增白剂线性方程、线性范围、相关系数、检出限(LOD)及定量限(LOQ)见表1。

2.7方法加标回收和精密度实验

加标回收实验中选取3个添加水平，每个添加水平进行6次重复实验，所得方法加标回收率及相对标准偏差(RSD)见表2。由表2可知，3种荧光增白剂的加标回收率在79%～90%，相对标准偏差在2.5%～4.3%，方法的准确度和精密度达到检测白灵菇中荧光增白剂的要求。

表1 3种荧光增白剂的线性关系、仪器检出限及方法定量限Table 1 Linear relationships，limits of detection and limits of quantification of the analytes/(μg·mL-1)

表2 3种荧光增白剂的加标回收率和精密度实验Table 2 Recovery and precisions of the analytesspiked in a blank sample(n=6)

3 结论

建立了白灵菇中3种荧光增白剂的高效液相色谱分析方法，同时对提取条件进行研究，该方法简单准确，线性关系、重现性及加标回收率均满足分析要求。利用此方法进行了白灵菇中3种荧光增白剂的提取条件实验，乙醇-水(V/V=1/2)溶液与50 ℃水浴静置提取是效率较高的提取条件。

[1] 中华人民共和国卫生部. 关于公布食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单(第四批)[EB/OL].[2010-03].http//www.jdzx.net.cn/article/40288ce4062bb60401062bb60cef0015/2011/4/2c90948e2f8abdc1012f8b28d12f0006.html.

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DeterminationofFluorescentWhiteningAgentsinMushroombyHPLC

ZHANG Chunfang1，CAO Xiumei2，TONG Qi1*，YANG Weijun2，ZHANG Jianan2, YANG Zhaowei2

(1.HebeiKeyLaboratoryofAppliedChemistry，CollegeofEnvironmentalandChemicalEngineering,YanshanUniversity，Qinhuangdao,Hebei066004,China；2.QualitySafetySupervisionandInspectionCenterofAgriculturalProductinQinhuangdao，Qinhuangdao,Hebei066004,China)

A method for the determination of three fluorescent whitening agents (FWAs) (VBL, CBS, CXT) in mushroom by high performance liquid chromatography was developed. The sample was extracted with ethanol-water (V/V=1/2) solution by static extraction of water for 15 min at 50 ℃. The HPLC method was performed on a column of Thermo Fisher Accucore C18 (250 mm×4.6 mm, 2.6 μm) with elution using 20 mmol/L ammonium acetate (65%) and acetonitrile (35%) as the mobile phases with the flow rate of 0.8 mL/min. The target analytes showed good linearity in the range of 0.01—10 μg/mL with the correlation coefficients (r2) greater than 0.997. The recoveries were in the range between 79%—90%.

mushroom; fluorescent whitening agents(FWAs); high performance liquid chromatography(HPLC)

10.3969/j.issn.2095-1035.2017.03.002

O657.7+2；TH833

A

2095-1035(2017)03-0004-04

2017-03-01

2017-04-10

河北省高层次人才资助项目(A2016002037)资助

张春芳，女，在读研究生，主要从事分析化学、色谱分析技术在食品及环境样品检测中的应用研究。E-mail: 18931902786@163.com

*通信作者：佟琦，女，副研究员，主要从事分析化学、色谱分析技术研究。E-mail: tongqi@ysu.edu.cn

本文引用格式：张春芳,曹秀梅,佟 琦,等. 高效液相色谱法测定白灵菇中荧光增白剂含量[J].中国无机分析化学,2017,7(3):4-7. ZHANG Chunfang，CAO Xiumei，TONG Qi,et al. Determination of Fluorescent Whitening Agents in Mushroom by HPLC [J].Chinese Journal of Inorganic Analytical Chemistry, 2017,7(3):4-7.