酶-碱结合法提纯豆渣纤维及其特性表征

李佩燚， 侯青青， 李新平， 刘 旭， 陈丽红

(1.陕西科技大学 轻工科学与工程学院 陕西省造纸技术及特种纸品开发重点实验室 教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室 中国轻工重点实验室， 陕西 西安 710021； 2.轻化工程国家级实验教学示范中心(陕西科技大学)，陕西 西安 700021; 3.陕西科技大学 化学与化工学院, 陕西 西安 710021)

酶-碱结合法提纯豆渣纤维及其特性表征

李佩燚1,2， 侯青青1,2， 李新平1,2， 刘 旭1,2， 陈丽红3

(1.陕西科技大学 轻工科学与工程学院 陕西省造纸技术及特种纸品开发重点实验室 教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室 中国轻工重点实验室， 陕西 西安 710021； 2.轻化工程国家级实验教学示范中心(陕西科技大学)，陕西 西安 700021; 3.陕西科技大学 化学与化工学院, 陕西 西安 710021)

以豆渣为原料，探讨了酶-碱结合法提纯豆渣纤维的工艺条件.结果表明，碱处理和蛋白酶处理的最佳工艺条件分别为：碱处理时间60 min、温度65 ℃、pH11,蛋白酶的添加量0.3%(w/w)、酶解时间1 h、酶解温度55 ℃、pH6，此时产品的得率为80.47%.对处理后豆渣的红外光谱和扫描电镜分析表明，酶-碱结合法可以有效去除附着在纤维表面的蛋白质、脂类等物质，使纤维表面变得光滑.碱处理后豆渣纤维的平均长度、宽度减少，蛋白酶处理后纤维长度和宽度基本没有变化，酶-碱结合处理后纤维的平均聚合度和分子量都有一定下降.

豆渣； 蛋白酶； 碱处理； 纤维特性

Abstract:The soybean dreg fibers were prepared by the methods of alkaline solution extracting and enzymatic hydrolysis from byproduct of soymilk.The treatment conditions of alkali treatment and protease hydrolysis were discussed by orthogonal test.The results showed that the optimum technology condition of alkali treatment was that pH value was 11,soaking time was 60 min and soaking temperature was 65 ℃.The condition of protease hydrolysis was that the ratio of enzyme to substrate was 0.3%,pH value was 6,hydrolysis time was 1 h,the temperature was 55 ℃.Under the above conditions,the yield of product was 80.47%.The FTIR spectrum and SEM were indicated that the protein and lipid attached to the fiber surface,they could be effectively removed by alkaline solution extracting and protease hydrolysis and they made the fiber surface smooth.After alkali treatment the average length and width of soybean fiber decreased.However,the fiber length and width could not be changed obviously after protease hydrolysis.The average polymerization degree and molecular weight of soybean fibers decreased after alkali and protease hydrolysis.

Keywords:soybean dregs； protease； alkali treatment； fiber characteristic

0 引言

豆渣是生产豆腐或豆奶过程中所产生的副产品，它是大豆加工行业中最大的副产物(约占全豆干重15%～20%)，我国每年约产2000万吨的湿豆渣[1].由于湿豆渣的水分含量较高，通常为78%～85%，运输困难，容易腐蚀变质，因此必须及时加工或者干燥后运输、保存[2].豆渣作为一种重要的农业废弃物资源，由于其热能低并且口感粗糙，长期以来并没有得到人们的广泛关注，其中只有极少部分的豆渣作为食用消费，而大部分的豆渣作为饲料、肥料或者丢弃.这样不仅使得豆渣没有得到充分的开发利用、经济效益低，而且浪费资源，造成了环境污染[3].

由于豆制品的生产工艺不同，所以产生的副产物豆渣的组成成分也有所差异.通常豆渣主要含有蛋白质、脂肪、膳食纤维、矿物质、维生素、异黄酮和其他碳水化合物等物质[4].豆渣中有效成分的提取包括不溶性膳食纤维、可溶性膳食纤维、分离蛋白等.其中豆渣膳食纤维的制备方法包括了纤维素酶法[5]、高温蒸煮结合纤维素酶法[6]、超声波结合木瓜蛋白酶法[7]、植物复合酶法[8]，并可利用豆渣纤维研制成本低、性能好、绿色环保的可食性包装纸[9].由于豆渣中含有一定量的蛋白质和脂类物质，而蛋白质会影响产品的纯度，不饱和脂肪酸容易发生化学变化产生特殊的豆腥味，因此在制备豆渣纤维时，尽可能的将两者去除[10].豆渣的豆腥味可以通过加热的方法加以去除.豆渣蛋白由于溶解性较低，加入蛋白酶可以增加蛋白质的溶解度，改善其品质.Chan等[11]通过加入胰蛋白酶水解豆渣分离蛋白，使其溶解度增加大于两倍，也改善了其水合能力和乳化能力.大豆纤维的结构上存在亲水基团，并且侧链上存在较多的羧基和羟基等负电荷集团，使它具有较强的亲水性和阳离子交换能力.纤维素、半纤维素的分子较大，与果胶等结合形成的网状结构，具有较强的吸附能力，使它在酸性乳制品、可食用膜等领域具有广泛的应用价值[12-14].

本文通过对豆渣主要成分进行分析，采用蛋白酶-碱结合的方法对豆渣进行处理，研究了蛋白酶-碱结合处理豆渣的最佳工艺参数，对处理后的豆渣的化学结构进行了分析与表征，研究蛋白酶-碱结合处理对豆渣纤维表面形态、纤维长度、宽度的影响，从而为豆渣这一价格便宜、来源广泛的纤维原料的进一步开发和利用提供一定的理论依据.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

(1)主要试剂：豆渣,取自东北某豆奶厂，干燥，过40目筛；蛋白酶,酶活为10万U/g，购自绿微康生物工程有限公司；氢氧化钠，为分析纯.

(2)主要仪器：FD-1A-50型冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司；HZ5H型水浴振荡器，哈尔滨市东明医疗仪器厂；PB-10型Ph计，南京荣华科学器材有限公司；S-4800型扫描电子显微镜，日本日立公司；VECTOR-22型，傅里叶红外光谱仪；MorFi Compact纤维形态分析仪，法国Techpap公司.

1.2 实验方法

1.2.1 豆渣基本成分的测定

(1)水分含量测定：GB 5009.3-2010，干燥法；

(2)粗脂肪含量的测定：GB/T 14772-2008，索氏抽提法；

(3)蛋白质含量测定：NYT 2007-2011，杜马斯燃烧法；

(4)灰分含量测定：GB 5009.4-2010，灼烧法；

(5)综纤维素含量的测定：GB/T 2677.10-1995，亚氯酸钠法；

(6)α-纤维素含量的测定：GB/T 744.10-1989，NaOH法.

1.2.2 提取工艺流程

干豆渣→碱预处理→蛋白酶脱蛋白质沸水浴灭活→ 冷冻干燥→提纯的豆渣纤维

1.2.3 脱脂：利用无水乙醚或石油醚(沸程30 ℃～60 ℃)抽提6 h，除掉脂肪.

1.2.4 酶-碱结合的方法

称取3.0 g的豆渣原料于锥形瓶中，按照料液比为1∶20(g/mL)加入定量的蒸馏水，用1 mol/L NaOH溶液调节pH到12，然后置于恒温水浴中，在一定的温度下反应一段时间.反应结束后取出并冷却，用乙酸调节pH，再加入一定量的蛋白酶，然后放置到恒温水浴振荡器中，在一定温度下反应一段时间.反应结束后立即用沸水浴灭活10 min，用布氏漏斗抽滤，蒸馏水反复洗涤，最后将收集到的纤维转移到已干燥至恒重的培养皿中，冷冻干燥12 h，得到豆渣纤维.

1.3 分析检测

1.3.1 表面形貌分析

取少量干燥后的样品，用导电胶将其固定在载物台上，经过表面喷金，用S-4800型扫描电子显微镜观察，加速电压为5 kV.

1.3.2 纤维形态分析

设定MorFi Compact纤维形态分析仪测量的纤维数为5 000根，浓度为30 mg/L.取一定量的样品，用1 000 mL的纯净水稀释，并用标准浆料疏解器使其充分解离，最后用MorFi Compact纤维形态分析仪测定其平均长度、宽度、卷曲率等纤维形态参数.

1.3.3 红外光谱

先将样品与KBr进行干燥处理，然后取一定量的样品(1～2 mg)与干燥后的KBr充分研磨使其混合均匀(样品与KBr的质量比为1∶100)，再将混合后的粉末置于干净的模具中，用油压机压成透明薄片，最后放入红外光谱仪中进行测量.

1.3.4 聚合度

先用铜乙二胺溶液将纤维溶解成纤维素的溶液，然后通过测定纤维素溶液的黏度来计算纤维素的聚合度(DP)：

(1)

2 结果与讨论

2.1 豆渣的组成

豆渣主要成分如表1所示.由表1可知，豆渣中综纤维素、α-纤维素的含量较高为提纯豆渣纤维提供了一定的基础.除此之外，蛋白质和脂肪的含量也较高，由于蛋白质会直接影响产品的纯度，不饱和脂肪酸发生化学变化会产生豆腥味[10]，因此在制备豆渣纤维素时要尽可能的将它们去除[15].

表1 豆渣的主要成分

注：各个组分的含量相对于绝干豆渣计算.

2.2 豆渣纤维制备工艺的研究

2.2.1 碱处理工艺的确定

以反应pH值(A)、反应温度(B)、反应时间(C)等为影响得率的主要因素.采用三因素三水平的正交试验来优化碱处理工艺，其设计方案及结果如表2、3所示.

表2 碱处理正交试验因素水平表

表3 碱处理正交试验结果表

根据表3中的试验序号的工艺条件进行试验,并分别测定了产品的得率，每次试验平行做3次，取其平均值.正交试验的结果的极差分析如表4所示.由表4可知，各个因素对产品得率的影响次序为B>A>C，即碱处理时反应温度的影响最为显著，其次是反应的pH值，最后是反应时间.由此可以得出碱处理的最佳工艺参数为A1B2C2，即反应pH、温度、时间分别为11、65 ℃、60 min，此时产品的得率为88.99%.

表4 碱处理工艺试验结果极差分析

在正交试验的基础上，通过单因素试验进一步了解反应pH值对产品得率的影响，其结果如图1所示.

图1 溶液的pH对得率的影响

由图1可以看出，当pH<11时，随着pH值的增加，产品的得率也增加；当pH>11时，随着pH值增加，产品得率减小，因此最佳的pH值为11.这是因为当pH<11时，碱液除了作用于底物中纤维素外，也作用于底物中的蛋白质、脂肪等物质.因为pH在一定的范围内，蛋白质的溶解度随pH的增加而增加，由于OH-所带的负电荷与蛋白质所带的负电荷相互排斥，使得蛋白质的溶解作用和扩散作用增强[16].当pH>11时，蛋白质的溶解度降低，纤维素的降解增加，使得产品的得率减少.这是因为当pH超过一定范围时，蛋白质的溶解度随pH的增加而减小，由于此时脱氨、脱羧和肽键断裂等副反应会发生[17]，并且由于OH-占主导作用，使-COO-增加了分子间静电斥力，离散的双电子层加厚，溶液界面膜增厚，易于形成胶束，进而导致蛋白质的溶解和扩散作用降低[18].

2.2.2 蛋白酶工艺的确定

为了得到更为纯净的豆渣纤维，经过碱处理后的豆渣在利用蛋白酶进行进一步的处理，其中碱处理的条件采用上述的最佳工艺条件进行.通过预实验得到影响酶处理的主要因素是温度(A)、pH(B)、蛋白酶添加量(C)、反应时间(D).设计四因素三水平的正交试验来优化酶处理工艺，其因素水平和实验方案及结果如表5、6所示.

表5 蛋白酶处理正交试验因素水平表

表6 蛋白酶处理正交试验结果及极差分析表

根据表6中的实验序号的工艺条件进行实验， 并分别测定了产品的得率，每次实验平行做3次，取其平均值.从正交试验的结果可以看出，各个因素对产品得率的影响次序为B>C>D>A，即蛋白酶处理时pH的影响最为显著，其次是蛋白酶的浓度和反应时间，最后是反应温度.由此可以得出蛋白酶处理的最佳工艺参数为A3B1C2D1，即反应温度、pH、浓度、时间分别为55 ℃、6、0.3%、1 h，此时产品的得率80.47%.与原料相比，酶-碱结合处理后各组分的含量均有一定的变化，用最佳工艺条件处理之后，产物中综纤维素、α-纤维素、蛋白质的含量分别为83.42%、78.63%、3.56%.由此可以看出，酶-碱结合处理有效的去除了豆渣中的蛋白质，使得纤维素的含量增加.

2.3 酶-碱结合处理对纤维表面形态的影响

由图2(a)可以观察到，未经处理的豆渣表面有许多大小不一，形状各异的物质，并且纤维的表面粗糙，有褶皱，内部由纤维素类物质形成支撑主体.由图2(b)可以看出，经过碱预处理后纤维表面的褶皱减少，表面变得疏松，表面杂质类物质减少.由图2(c)可以看出，当再进一步用蛋白酶处理后，纤维表面变得光滑，已经没有颗粒物质附着在纤维表面.由此可以得出，酶-碱结合法可以有效的去除豆渣中的杂质，得到纯度较高的豆渣纤维素.

2.4 酶-碱结合处理对纤维形态参数的影响

(a)原料

(b)碱处理

(c)蛋白酶处理图2 经不同工艺处理后纤维的扫描电镜图(碱 处理和蛋白酶处理的条件均为最佳工艺)

由图3可以看出，豆渣纤维的长度在0.3 mm左右，其中原料的纤维长度为0.332 mm，碱处理之后，纤维长度变为0.309 mm，减少了6.93%，降低的比较明显，而经过蛋白酶处理后纤维的长度为0.300 mm，与碱处理之后的纤维长度相比较基本没有变化.造成这种结果的原因是在碱性条件下，纤维素会发生降解反应，部分糖苷键断裂，使纤维长度降低；而蛋白酶具有专一性，所以蛋白酶处理时，只有蛋白质发生降解反应，并没有破坏纤维素的分子链，所以纤维长度基本没有变化.

图3 不同工艺处理后纤维长度变化(碱 处理和蛋白酶处理的条件均为最佳工艺)

由图4可以看出，纤维的宽度大概在50μm左右，原料纤维的宽度为51.2μm，碱处理之后下降为48.5μm，下降了5.27%.这是因为碱处理过程中，粘附在纤维表面的脂肪、蛋白质等杂质被去除，纤维宽度变小，同时，在碱性条件下，纤维的外层发生溶解或者剥落，使得纤维宽度降低.蛋白酶处理后纤维宽度也基本没有变化，这也是由于蛋白酶的专一性造成的.由以上分析可知，豆渣纤维本身的长度、宽度都比较小，因此为它以后开发纳米纤维素产品提供了一定的条件.

图4 不同工艺处理后纤维宽度的变化(碱 处理和蛋白酶处理的条件均为最佳工艺)

2.5 酶-碱结合处理对豆渣纤维结构的影响

红外光谱广泛地被用于测量聚合物在分子水平上的结构与功能[19].未处理的豆渣和通过酶-碱结合处理后的豆渣的红外光谱图如图5所示，其中酶-碱结合处理的条件采用上述研究过程得出最佳工艺参数进行.

由图5可见，与未处理的豆渣的特征吸收峰相比较，酶-碱结合处理后的豆渣的特征吸收峰的位置基本没有变化，说明预处理没有改变豆渣纤维的主要化学成分.在波数为3 394 cm-1的特征吸收峰是由-OH和-NH的伸缩振动引起的，由于分子间氢键和分子内氢键多分子缔合，因此吸收峰呈一个宽的吸收带；2 935 cm-1附近的吸收峰是甲基(-CH3)和亚甲基(-CH2-)的伸缩振动引起的；1 373 cm-1处的吸收峰是甲基-CH3的弯曲振动引起的；1 049 cm-1处的吸收峰是由纤维素中C-O键的伸缩振动和O-H键的弯曲振动引起的.1 741 cm-1主要是半纤维素中没有结合的羰基和半纤维素中阿魏酸或对香豆酸的酯基中的羰基的吸收峰，酶-碱结合处理之后，它消失说明半纤维素在酶-碱结合处理的过程中被溶解[20-22].除此之外，在1 741 cm-1、 1 541 cm-1、1 248 cm-1处附近可能存在来自蛋白质、脂类的羰基、环乙酰基的伸缩振动[23].由图5可以看出经过酶-碱处理后1 541 cm-1和1 248 cm-1的峰消失，说明有一部分的蛋白质、脂肪被溶解，这与扫描电镜观察的现象一致.

a：未处理的豆渣； b：处理后的豆渣图5 未处理的豆渣和酶-碱结合 处理后的豆渣红外光谱图

2.6 酶-碱结合处理对豆渣纤维聚合度的影响

表7是酶-碱结合处理后豆渣纤维的平均聚合度和分子量的变化情况.由表7可以看出，酶-碱结合处理后豆渣纤维的平均聚合度和分子量都减少.纤维素的聚合度表示纤维素分子链中所连接的葡萄糖单元数目[24]，间接的可以表示出纤维素分子链的长短.由表7可知，未处理的豆渣的聚合度为278，基本达到普通微晶纤维素的程度；处理后的豆渣聚合度为255，下降了8.27%.在碱处理的过程中，纤维素会发生降解反应，导致纤维素大分子链逐渐断裂，纤维素的平均聚合度减小，而纤维素的平均聚合度的大小可以反映出纤维素分子量的大小，因此纤维素的分子量也减少.

表7 酶-碱结合处理对聚合度的影响

3 结论

(1)酶-碱结合处理豆渣的最佳工艺条件如下：碱处理的工艺为反应pH是11、温度是65 ℃、时间是60 min；蛋白酶处理的条件为反应温度是55 ℃、pH是6、蛋白酶的添加量是0.3%(w/w)、反应时间是1 h，此时的得率为80.47%.

(2)通过酶-碱结合处理可以有效的去除豆渣纤维表面附着的蛋白质、脂类等物质，使纤维表面变得光滑，纤维的长度和宽度都减少，平均聚合度有一定降低，为豆渣进一步开发成纳米纤维素提供了一定的理论基础.

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【责任编辑：蒋亚儒】

Preparationandcharacterizationofcellulosefromsoybeandregsbyalkalitreatmentandproteasehydrolysis

LI Pei-yi1，2， HOU Qing-qing1，2， LI Xin-ping1，2， LIU Xu1，2， CHEN Li-hong3

(1.College of Bioresources Chemical and Materials Engineering, Shaanxi Province Key Laboratory of Papermaking Technology and Specialty Paper, Key Laboratory of Auxiliary Chemistry and Technology for Chemical Industry, Ministry of Education, Key Laboratory of Paper Based Functional Materials, China National Light Industry, Shaanxi University of Science & Technology，Xi′an 710021，China； 2.National Demonstration Center for Experimental Light Chemistry Engineering Education (Shaanxi University of Science & Technology), Xi′an 710021，China; 3.College of Chemistry and Chemical Engineering， Shaanxi University of Science & Technology， Xi′an 710021， China)

2017-08-15

陕西省科技厅自然科学基础研究计划项目(2015JM3118)； 浙江省废弃生物质循环利用与生态处理技术重点实验室开放基金项目(2016REWB20)； 天津市制浆造纸重点实验室开放基金项目(201608)； 陕西科技大学博士科研启动基金项目(BJ15-29)

李佩燚(1981-)，女，陕西宝鸡人，副教授，博士，研究方向：植物资源高值化利用、纤维素功能材料

2096-398X(2017)05-0016-06

TQ353

A