超高效液相色谱串联质谱法检测鸡粪中16种残留抗生素

吴丹 韩梅琳 邹德勋 王旭明 高敏+仇天雷

摘要建立了固相萃取超高效液相色谱串联质谱（UPLCMS/MS）同时检测畜禽粪便中四环素类、磺胺类、氟喹诺酮类和大环内酯类16种抗生素的分析方法。针对目标物化学性质和样品杂质情况，对质谱条件、提取液种类、超声功率等参数进行了优化。最终以50%乙腈（V/V）的磷酸盐缓冲溶液（pH=4）提取3次，经过超声、离心、旋蒸、稀释后，SAXHLB串联小柱净化富集，用10 mL甲醇丙酮混合液（80∶20，V/V）洗脱，35℃氮吹近干后，用含0.1%甲酸甲醇（1∶1， V/V）定容，在UPLCMS/MS多反应检测模式下进行定性及定量分析。结果表明，粪便中四环素类、磺胺类、氟喹诺酮类和大环内酯类抗生素的平均加标回收率为56.4%～94.6%，相对标准偏差（RSD）在2.6%～19.8%之间，方法检出限（LOD， S/N=3）和定量限（LOQ， S/N=10）分别为0.01～2.50 μg/ kg和0.05～7.90 μg/kg。本方法简便、稳定性好、灵敏度高、重现性好，适用于畜禽粪便中多种抗生素的同时检测。

关键词四环素类； 磺胺类； 氟喹诺酮类； 大环内酯类； 固相萃取； 超高效液相色谱串联质谱； 畜禽粪便

1引 言

抗生素在促进动物生长、预防和治疗动物疾病等方面具有重要作用，因此被广泛用于畜禽养殖业[1]。据统计，2013年我国抗生素总使用量约16.2万吨，其中52%为兽用抗生素[2]。摄入动物体内的抗生素大多未能被充分吸收，約有60%～90%的抗生素以原型或代谢产物的形式随粪尿排放到环境中，人为地增加了土壤或水体环境中抗生素含量[3，4]，提高了环境中抗性基因丰度，给人类健康和生态环境带来长期、潜在的危害[5]。目前，畜禽粪便中抗生素的处理主要有好氧发酵和厌氧消化两种途径，大量研究表明，好氧发酵可以更有效地降解畜禽粪便中抗生素[6，7]。为了更有效地监测畜禽粪便中抗生素残留，提高抗生素在环境中的检出效率，建立有效的前处理方法，减少基质干扰，发展灵敏、可靠的分析技术是研究抗生素环境残留的基础。

目前，畜禽粪便中抗生素药物残留的检测技术有酶联免疫检测技术（Enzymelinked immunosorbent assay， ELISA）[8，9]、气相色谱质谱联用技术（Gas chromatographymass spectrometry， GCMS）[10]、毛细管电泳分析技术（Capillary electrophoresis detection technique，CE）[11]、液相色谱技术（Liquid chromatography， LC）[12～14]和高效液相色谱质谱（HPLCMS）[15]等。酶联免疫检测技术操作简单，但对试剂的选择性高，不能同时分析多种成分； 气相色谱质谱联用技术灵敏度高，且具有广泛的谱库，适合分析挥发性成分，缺点是测定前需要采用衍生化处理，操作繁琐，稳定性差； 毛细管电泳检测技术分辨率高，进样量少，保留时间短，但是灵敏度低，重现性差； 液相色谱检测技术测定范围广， 可灵活调节流动相的组成和pH值，能够使相当数量极难分离的待测物质得以测定，与质谱检测器串联可以提高灵敏度和精确度，已成为应用广泛的检测分析技术[16～18]。

本研究采用具有高灵敏度和高选择性的固相萃取超高效液相色谱质谱联用方法，建立了鸡粪中四环素类、磺胺类、喹诺酮类和大环内酯类等16种抗生素的快速检测方法。经优化后，本方法以50%乙腈的磷酸盐缓冲液提取3次，确保目标物的提取效率； 同时采用液相色谱质谱联用法检测，保证了样品检测的灵敏度。采用本方法优化的提取液和旋蒸的净化方式，得到的目标物回收率更高，方法检出限和定量限更低。结果表明，本方法简便、快速、准确、灵敏，可在25 min内完成粪便中四环素、磺胺、氟喹诺酮和大环内酯类16种抗生素的同步提取与同时测定。

2实验部分

2.1仪器与试剂

UltiMate 3000超高效液相色谱、Thermo LTQ XL离子阱质谱（美国Thermo公司）； Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm，美国Thermo公司）； SAX阴离子交换柱（3 mL/200 mg，美国Thermo公司）； HLB小柱（6 mL/500 mg，美国Waters公司）； 十二孔固相萃取装置（美国Supelco公司）； AvantiTMJ20XP离心机（美国Beckman Coulter公司）； NEVAPTM111氮吹仪（美国Organomation公司）； RE52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）； QL901旋涡混合器（海门市其林贝儿仪器制造有限公司）。

目标物盐酸土霉素（OTC）、四环素（TC）、盐酸金霉素（CTC）、强力霉素（DOX）、磺胺对甲氧嘧啶（SM）、磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺氯哒嗪（SCP）、磺胺甲恶唑（SMX）、磺胺二甲氧嘧啶（SDM）、磺胺喹噁啉（SQ）、诺氟沙星（NOR）、盐酸环丙沙星（CIP）、恩诺沙星（ENR）、红霉素（ERY）、罗红霉素（ROX），均购于中国食品药品检定研究院； 泰乐菌素（TS）和醋酸钠购于SigmaAldrich公司。

甲醇、乙腈（色谱纯，Fisher公司）； 实验用水为超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm）； Na2EDTA、Na2HPO4、HCl、NaOH、H3PO4等均为分析纯。

2.2标准溶液与缓冲溶液配制

将1 L 0.1 mol/L柠檬酸溶液和625 mL 0.2 mol/L Na2HPO4溶液混合，配制成McIlvaine 缓冲溶液。必要时用0.1 mol/L HCl或NaOH调至pH 4.00±0.05。将McIlvaine 缓冲溶液和乙腈溶液按1∶1（V/V）混合，制得提取液。

准确称取上述13种抗生素目标物标准品各10 mg，以甲醇溶解并定容至100 mL棕色容量瓶，配制成100 mg/L混合标准储备液，诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星用0.1%甲酸甲醇（1∶1，V/V）溶液溶解并定容至100 mL， 在endprint

Symbolm@@ 20℃保存。使用时，用0.1%甲酸甲醇（1∶1，V/V）稀释至所需浓度。

2.3样品的采集和样品前处理

蛋鸡和肉鸡鸡粪采集自北京市平谷、怀柔、密云、大兴等地区的规模化养鸡场，堆肥样品采集自北京市怀柔区某堆肥厂，空白鸡粪样品（不含抗生素）采集自重庆市某农家鸡舍。

将采集的样品自然风干后，过2 mm孔径筛，称取1 g研磨样品于50 mL离心管中，加入提取液10 mL，涡旋1 min，超声提取15 min，8000 r/min离心10 min（10℃），上清液转移至蒸馏瓶中。反复提取3次后，合并上清液。在35℃水浴下旋转蒸发至乙腈完全挥发，用超纯水稀释至200 mL，加入0.4 g Na2EDTA，溶解以螯合阳离子。将HLB小柱和SAX小柱依次用5 mL甲醇和5 mL水活化，用固相萃取适配器将SAX和HLB小柱串联。开启真空泵，控制流速约为3～5 mL/min，将提取液上柱。过柱完成后，用10 mL超纯水冲洗串联柱，抽气干燥10 min，拆下SAX小柱，将HLB柱于N2保护下干燥10 min。最后，加入洗脱液（甲醇丙酮，80∶20，V/V）10 mL，收集洗脱液， 在35℃水浴下用N2吹至近干，加入1 mL 0.1%甲酸甲醇（1∶1，V/V）溶液， 涡旋1 min， 0.22 μm膜过滤后检测。

2.4优化的仪器工作条件

2.4.1色谱条件Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱（100 mm×2.1 mm×3 μm），柱温35℃； 进样体积： 15 μL； 流速： 0.35 mL/min。四元梯度泵，流动相A为0.1%（V/V）甲酸和5 mmol/L乙酸铵，流动相B为甲醇，流动相C为超纯水，流动相D为含0.1%甲酸的乙腈溶液。采用流动相A、D，具体的线性梯度如下： 0 min，5% D； 0～4 min，5%～16% D； 4～8 min，16%～40% D； 8～15 min，40%～65% D； 15～20 min，65%～95% D； 20～25 min，5% D。

2.4.2质谱条件质谱系统由Thermo LTQ XL检测器和离子源组成。离子源： 电喷雾电离（ESI+）； 加热温度： 350℃； 鞘气流速： 35 aribitrary unit（arb，自定义单位），輔助气流速10 arb， 喷雾电压3.5 kV， 离子传输管温度： 350℃， Tube Lens电压： 65 V； 检测方式： SRM。各物质的检测参数见表1。

3结果与讨论

3.1缓冲液种类的选择

综合考虑所检测的16种抗生素的pKa[19]， 参考美国EPA推荐方法及文献[20，21]， 分别以Na2HPO4、柠檬酸钠和NaH2PO4与柠檬酸按一定比例配制McIlvaine 缓冲溶液， 与乙腈按1∶1（V/V）比例混合作为提取液， 提取400 μg/kg的加标空白鸡粪样， 含乙腈的提取液用超纯水稀释至200 mL后过柱。如图1所示， 以柠檬酸钠作为缓冲液提取时， 四环素类和大环内酯类的平均回收率>60%， 但磺胺类和氟喹诺酮类的回收率<50%。以NaH2PO4作为缓冲溶液提取时， 四环素类、磺胺类和大环内酯类回收率>50%， 多数在60%～95%之间， 但是对氟喹诺酮类提取效率非常低。Na2HPO4作为缓冲溶液可以实现四类抗生素物质的同时提取， 16种抗生素中回收率在48%～93%之间。因为在低pH值下， 目标抗生素均以中性分子和阳离子态为主， 不易被SAX柱保留， 从而提高了目标抗生素的回收率[22～25]。

3.2超声功率优化

在超声功率分别为50、60和300 W下对抗生素进行提取（图2）， 结果表明， 超声波的空化作用可以增加有机相和水相间的接触面积， 提高萃取速率， 但是超声功率过大， 会导致待提取物降解， 影响抗生素的提取效果[26，27]。在超声功率为60或300 W时， 磺胺类的回收率>50%， 而喹诺酮类的回收率低于10%。超声功率为50 W时， 四大类抗生素的回收率在60%～97%之间， 提取效果最好。

3.3Na2EDTA用量对回收率的影响

在固相萃取前用超纯水稀释至200 mL， 分别加入0.2和0.4 g Na2EDTA螯合溶液中的阳离子（图3）。结果表明， Na2EDTA的用量对四环素类、磺胺类和大环内酯类的回收率影响不大， 但是对氟喹诺酮类的回收率影响较大。Na2EDTA用量为0.2 g时， 氟喹诺酮类回收率约为20%； Na2EDTA用量为0.4 g时， 氟喹诺酮类回收率在58%～62%之间。这可能是由于Na2EDTA充分络合粪便中的金属离子， 减少抗生素与粪便中金属离子鏊合， 增加了固相萃取柱对氟喹诺酮类抗生素的吸附， 从而提高了氟喹诺类抗生素的回收率[24]。

3.4方法的回收率

采用以上固相萃取条件优化结果， 选取空白鸡粪添加混合标准溶液， 添加水平分别为100和250 μg/kg， 每个添加水平取3个平行样， 计算各目标物基质效应、回收率及相对标准偏差（RSD）， 结果见表2。根据Matuszewski等[28]的方法， 绝对基质效应（Matrix effect）为样品基质提取后加标除以纯的标准品溶液得到， 相对基质效应为选择6个不同来源（猪粪、鸡粪、牛粪、污泥、土壤和污水）样品的基质效应， 计算变异系数得到相对基质效应。 16种抗生素的回收率为54.5%～97.9%， 方法相对偏差为2.6%～19.8%。与文献[29]中四类抗生素加标回收率42.3%～79.6%， 文献[30]中磺胺类回收率47%～101%相比， 本方法的回收率明显提高， 更有利于鸡粪中抗生素的有效提取。

3.5方法学质量控制endprint

配制添加水平为10～500 μg/kg混合标准溶液按上述方法进行实验， 采用3倍信噪比计算检出限（LOD）， 10倍信噪比计算定量限（LOQ）， 结果见表3。16种抗生素的检出限为0.01～2.50 μg/kg， 定量限为0.05～7.90 μg/kg， 线性相关系数为0.9914～0.9996， 满足定量分析要求。与文献[29，31]的检出限为0.1～2.8 μg/kg， 定量限为0.3～6.6 μg/kg相比， 本方法具有更高的检测灵敏度。

3.6畜禽粪便样品分析

样品取自北京市郊区8个养鸡场和2个堆肥厂， 共10个样品。将采集的蛋鸡和肉鸡粪便样品风干后准确称取1 g，

按照2.3节前处理方法进行操作， 利用2.4节设定的条件进行UPLCMS/MS测定， 加标鸡粪样品的HPLCMS总离子流图如图4所示， 样品检测结果见表4。4类抗生素在两种粪便中均有不同程度检出， 最多可同时检出15种物质。四环素类、磺胺类、氟喹诺酮类和大环内酯等四类抗生素的浓度范围分别为： 蛋鸡鸡粪0.012～12.1 mg/kg， 0.0091～15.5 mg/kg， 0.0077～5.52 mg/kg， 0.0036～0.0436 mg/kg； 肉鸡鸡粪0.0792～11.6 mg/kg， 0.0064～3.12 mg/kg； 0.064～6.29 mg/kg， 0.0034～23.3 mg/kg。成品肥中四环素类、磺胺类、氟喹诺酮类和大环内酯等四类抗生素的浓度范围分别为0.0078～0.536 mg/kg、0.0057～0.0324 mg/kg、0.0137～0.0404 mg/kg、0.024～0.0722 mg/kg， 其中TC、CIP和TS在好氧发酵过程中被完全降解， 说明好氧发酵可以有效消减抗生素的种类和含量， 减少畜禽粪便中抗生素对生态环境造成的危害。

4结 论

采用50%乙腈的磷酸盐缓冲溶液提取， UPLCMS/MS检测， 外标法定量， 在10～500 μg/kg添加水平下， 16种抗生素在粪便中的平均回收率为54.5%～97.9%； 在鸡粪样品中总抗生素检出的浓度范围为0.0337～23.3 mg/kg， 经过好氧发酵后总抗生素最高浓度残留量为0.536 mg/kg， 说明好氧发酵是一种可以消减畜禽粪便中抗生素残留污染的有效途径。样品经过好氧发酵后， 四大类抗生素均有不同程度消减， 有的抗生素被完全去除， 如TC、CTC、SM、CIP和TS在高溫好氧发酵过程中被降解至检出限以下。本方法灵敏度高， 检出限低， 稳定性好， 可用于畜禽粪便中抗生素含量的分析检测。

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Ultra Performance Liquid ChromatographyTandem Mass

Spectrometry Analysis of 16 Kinds of Residual

Antibiotics in Chicken Manure

WU Dan1，2， HAN MeiLin2， ZOU DeXun1， WANG XuMing2， GAO Min2， QIU TianLei*2

1（Department of Environmental Science and Engineering， Beijing University of Chemical Technology， Beijing 10029， China）endprint

2（Beijing AgroBiotechnology Research Center， Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Beijing 100097， China）

AbstractA sensitive and effective method for determination of 16 kinds of antibiotics， including tetracycline， sulfonamide， fluoroquinolone and macrolide， in livestock and poultry manure using solid phase extractionultrahigh performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （UPLCMS/MS） was established. Aiming at the chemical properties and sample impurities of the target， the parameters such as mass spectrum conditions， types of extraction and ultrasonic power were optimized. Finally， the samples were extracted with 50% acetonitrile in phosphate buffer solution （pH = 4） for three times， followed by ultrasonic steaming， centrifugal and rotary， dilution， and purified by SAXHLB. After sample loading， the solid phase was washed with 10 mL of methanolacetone （80∶20， V/V）， evaporated to near dryness at 35℃， and then redissolved and vortex mixed in 1 mL of 0.1% formic acid∶methanol （1∶1， V/V）. The extracts were analyzed with UPLCMS/MS and calculated by external standard method based on the monitored product ion. The results indicated that the average spiked recoveries of tetracycline， sulfonamide， fluoroquinolone and macrolide in manure were 56.4%-94.6% with relative standard deviations （RSDs） of 2.6%-19.8%， the LODs （S/N=3） were 0.01-2.50 μg/kg， and the LOQs （S/N=10） were 0.05-7.90 μg/kg. The method was simple with high stability， high sensitivity and good reproducibility， and suitable for the simultaneously determination of many antibiotics in animal and poultry manure.

KeywordsTetracycline； Sulfonamide； Fluoroquinolone； Macrolide； Solidphase extraction； Ultra performance liquid chromatographytandem mass spectrometry； Animal and poultry manure

（Received 20 March 2017； accepted 24 June 2017）

This work was supported by the Natural Science Foundation of Beijing， China （No.BAIC042017）， the National Science and Technology Major Project of the Ministry of Science and Technology of China （No.2016YFD0800205）， Key Research and Development Plan of Ministry of Science and Technology of China（No. 2017YFD0801402）and National Natural Science Foundation of China（No. 51308022）.endprint