水体总毒性在线检测仪器的研制

翟俊峰 余登斌+董绍俊

摘要研制了基于电化学媒介体法的水体总毒性在线检测仪器， 通过对比水样和标样中微生物的呼吸活性差异， 实现对水体总毒性的在线监测。毒性检测的受试体微生物为原位培养微生物。电化学检测采用三电极系统， 其中铂微阵列电极、Ag/AgCl（3 mol/L KCl）电极和金丝电极分别作为工作电极、参比电极和对电极。对浓度为5.0、10.0和20.0 mg/L的模型毒物3，5二氯苯酚（DCP）进行检测， 获得的微生物呼吸活性抑制率分别为24.4%、48.9%和59.2%。在连续在线监测过程中， 仪器能够对所有随机加入毒性物质（5.0 mg/L DCP）的水样输出毒性警报（以10%的呼吸抑制率为毒性报警临界值）， 表明此仪器可以用于水体总毒性在线检测和预警。

关键词水体急性毒性；在线检测；微生物；呼吸抑制

1引言

随着工农业的快速发展， 我国的水体环境日益恶化， 突发性水污染事件日益频繁。为了保障居民的用水安全和准确评估复合污染程度， 有必要进行水体急性毒性的在线检测。传统的生物毒性检测方法多基于生物终点的方法， 例如：死亡率、生长率、繁殖率等。采用的受试体则包括高等动物浮游生物（D. magna）、藻类、鱼类等。但是， 这些方法耗时长、成本高、需要专业的测试人员， 且存在道德争议[1～3]。近年来， 基于微生物的水体急性毒性检测方法得到快速的发展， 其中较为成熟的是以海洋细菌费希尔弧菌（Vibro fischeri）为毒性检测受试体的发光细菌法[4～6]。然而， 考虑到实际水体的浊度和色度对光学检测的影响、检测所需的高盐度对水体急性毒性测试结果的影响、较高的费希尔弧菌价格， 以及单一菌种对毒性的选择性， 发光细菌法在水体急性毒性的在线检测应用中受到一定的限制。

媒介体法是以微生物的呼吸抑制作用为毒性响应机理， 并以媒介体分子代替氧气作为微生物呼吸链中的电子受体， 最终通过检测媒介体分子的电化学信号实现水体急性毒性的快速检测[7～10]。2010年王学江等[11]开发了基于媒介体法的多通道生物毒性传感器， 该仪器通过使用固定有微生物的一次性生物芯片解决了微生物受试体的供给与电极污染问题， 适合实验室测试及应对突发事件的野外现场检测， 但是仍然需要人工更换芯片， 无法进行水体总毒性的自动在线检测。

本研究在前期工作的基础上， 开发了基于媒介体法的水体总毒性在线检测仪器。此仪器使用低温保存的原位培养微生物作为毒性检测受试体。建立了新的电极维护方法， 解决了电极的污染问题， 保证了在线检测数据的准确性与稳定性。使用此仪器对含有5.0、10.0和20.0 mg/L模型毒物3，5二氯苯酚（DCP）的水溶液进行检测， 测得的微生物呼吸活性抑制率分别为24.4%、48.9%和59.2%。 此外， 在线连续测试过程中， 仪器能够对所有随机加入的含有5.0 mg/L DCP的毒性样品进行毒性报警。结果表明， 此仪器不仅可以连续、自动检测水体总毒性， 还可用于水体总毒性的预警。

2实验部分

2.1仪器与试剂

802离心机 （浙江力辰仪器科技有限公司）； AtA7500气泵（中山市创星电器有限公司）； DK8AD恒温水浴槽 （常州市国旺仪器制造有限公司）； 酵母浸出粉（BR， 北京奥博星生物技术有限公司）； 蛋白胨（BR， 北京奥博星生物技术有限公司）； NaCl、K3Fe（CN）6（分析纯， 阿拉丁试剂有限公司）； DCP（SigmaAldrich公司）。1000 mL去离子水中加入100 g酵母浸出粉、40 g蛋白胨和100 g NaCl， 121℃湿热灭菌15 min， 冷却后获得微生物培养基母液， 在4℃保存， 备用。5 mmol/L K3Fe（CN）6溶液用去离子水配制， 室温避光放置于仪器内的药品储存杯中。

2.2微生物培养

用目标水（本研究为地下水）将微生物培养基母液稀释至所需体积， 稀释后的液体培养基浓度为母液的1/10。然后将此液体培养基在37℃恒温水浴中恒温并用气泵爆空气。14 h后， 离心收集微生物， 重新分散到体积为初始体积1/4的新鲜培养基中[12]。随后， 将此微生物溶液培养基于4℃保存， 或加入仪器的微生物溶液储藏罐中。

2.3毒性在线检测

2.3.1毒性检测原理此仪器使用微生物作为毒性检测受试体，并以微生物的呼吸抑制作用作为毒性响应原理[13]。当毒性物质存在时，微生物的呼吸活性受到抑制， 从而导致单位时间内微生物传递给人工电子媒介体 （K3Fe（CN）6）的电子的量减少， 即生成的K4Fe（CN）6的量减少。因此， 通过采用电化学方法检测K4Fe（CN）6的生成量， 即可实现对微生物呼吸活性的测试， 进一步通过对比微生物在水样和标样中的呼吸活性差异可实现对水体毒性的检测， 如图1所示。毒性的强度用呼吸抑制率表示， 其计算公式如图1所示。其中it是毒性物质存在条件下的K4Fe（CN）6阳极氧化的极限电流值， in是没有毒性物质存在条件下的K4Fe（CN）6阳极氧化的极限电流值。在线毒性检测过程中， 以10%的抑制率为毒性报警的预警值。抑制率超出10%时， 仪器输出报警。

2.3.2仪器结构及测试流程水体总毒性在线分析仪由机械部分和电子控制部分组成（见图2）。其中机械部分包含线性导轨、蠕动泵、转台、注射泵、电磁阀等， 用于实现反应器的转换、电极的移动、样品的加入、反应器清洗等操作。电子部分负责控制机械部分的运动并完成采集信号的处理和输出。电化学检测器采用三电极结构， 其中工作电极为铂微阵列电极， 参比电极为Ag/AgCl（3 mol/L KCl）參比电极， 对电极为金丝电极。工作电极的电位为0.4 V。仪器有3组反应器， 分别位于加样、反应和检测位置， 利用转台控制3组反应器的位置循环转换， 实现清洗、加样、反应过程同时进行， 缩短检测时间， 保证仪器的连续运行。每组反应器中包括两个反应池， 即水样反应池和标样反应池。endprint

樣品测试流程：利用蠕动泵将20 mL水样和标样分别加入到水样和标样反应池， 用注射泵向两个反应池中分别加入1 mL微生物和K3Fe（CN）6溶液， 并曝气混匀。待混合溶液反应1 h后， 机械臂悬挂的电化学检测探头分别浸入水样和标样进行电化学检测， 获取电流值it和in， 单个样品的检测结束。每次检测结束后， 反应池中加入1 mol/L NaOH溶液浸泡约20 min， 避免反应池内壁生成生物膜。电化学检测探头不工作时浸泡在9% （w/w）NaCl溶液中。样品检测前30 min， 电化学检测器浸入前一样品反应液中， 进行电极表面钝化处理直至开始当前样品检测， 当样品检测完成后， 电化学检测器重新浸泡到9% （w/w） NaCl溶液中。

3结果与讨论

3.1工作电极的维护

电极污染问题是电化学在线分析仪器的普遍问题。本仪器在测试过程中需要使用分散到培养基中的微生物， 因此微生物的加入必然给测试溶液带来大量的有机物。这些有机物可以通过氢键或者库伦作用等方式吸附到电极表面， 导致电极的电化学活性面积减小。为了解决吸附污染的问题， 本研究采用了本研究组前期工作[14]中的策略， 即利用吸附动力学随吸附时间延长而快速下降的特点， 在工作电极表面预先吸附有机物， 从而使得电极在测试样品时表现出较慢的有机物吸附动力学， 进而保证测试数据的稳定。如图3A所示， 当标准样和测试样为同一水源时， 工作电极连续测试水样和标准样的电流值一致， 因此， 预先吸附的方法能够抑制检测过程中有机物在电极表面发生吸附。然而， 水样和标准样的测试电流强度都表现出随时间延长而增大的特性， 这一特性表明， 电极表面生长了微生物膜。为抑制电极表面微生物的生长， 加入了将电极浸入到9% （w/w） NaCl溶液中的步骤， 利用渗透压变化引起微生物脱水死亡。由图3B可见， 增加的9% （w/w）NaCl溶液浸泡过程， 水样和标准样的测试极限电流值强度基本稳定不变， 表明微生物在电极表面的生长得到抑制。因此， 仪器使用的电极维护方法为在电极处于空闲时间时， 将电极连续浸泡在9% NaCl（w/w）溶液中和前一组水样测试溶液中， 其中在水样测试溶液中的浸泡时间固定为30 min， 以保证有机物的充分吸附。

3.2反应池的清洗

与悬浮微生物相比， 微生物膜对毒性物质具有更高的耐受性， 因此当反应池中有微生物膜生成时， 会降低仪器对毒性物质的检测灵敏度。以5 mg/L DCP为例， 当反应器内壁有微生物膜时， 其对受试体微生物的呼吸活性抑制率测试值约为6%。因此每次测试之后， 都会在反应池中加入约20 mL 1 mol/L NaOH溶液浸泡30 min， 利用强碱性溶液杀灭吸附在反应池内表面的微生物， 避免微生物膜的生成。

3.3水体总毒性的在线分析

在确定仪器维护方法的基础上， 以地下水为检测水体， 进行水体总毒性的在线连续测试。仪器用的标准水是相同来源的地下水（假设地下水无毒）。仪器在连续运行过程中， 随机对浓度为5.0、10.0和20.0 mg/L的DCP进行检测， 获得的微生物呼吸活性抑制率均值分别为24.4%、48.9%和59.2%， 展现了很好的剂量依赖的毒性响应特性。需要指出的是， 由于毒性物质对不同微生物的呼吸抑制效果不同， 当使用不同的微生物进行毒性测试时， 所得呼吸抑制率不同[15]。微生物对毒性物质响应的差异表明， 使用原位微生物种群进行毒性测试， 能够更有效反映复合污染对目标水体生态环境的影响。虽然使用DCP作为毒性物质进行测试， 但是实际测试的毒性响应是DCP与水中物质综合作用后的结果， 并非是单纯DCP与微生物作用的结果。当使用此仪器对自来水进行检测时， 5.0 mg/L DCP的微生物呼吸抑制率为50.0%， 明显高于用地下水时检测获得的呼吸抑制率值。

毒性预警是水体总毒性在线分析仪的主要功能， 本仪器将10%微生物呼吸活性抑制率作为毒性预警临界值， 当呼吸抑制率超出10%， 输出毒性报警信号。图4是仪器连续运行所得的抑制率图， 仪器在连续测试过程中能够对含有5 mg/L DCP的水样进行报警， 表明仪器具有很好的稳定性和可靠性。

4结 论

研发了基于媒介体法的水体总毒性在线分析仪器， 采用新颖的维护方法， 解决了电极污染、反应池微生物生长等问题， 保证了测试信号的稳定性和检测结果的可靠性。仪器的毒性报警功能， 可在突发水污染事件中确保用水安全。使用原位微生物作为毒性检测受试体， 能够更加有效反映水环境污染情况， 用于地表水的总毒性在线检测， 可为地表水环境复合污染评估及治理效果评估提供依据。

致 谢感谢吉林光大分析技术有限公司为仪器组装和测试提供的帮助。

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An Online Equipment for Monitoring of Water Total Toxicity

ZHAI JunFeng*， YU DengBin， DONG ShaoJun

（State Key Laboratory of Electroanalytical Chemistry， Changchun Institute of Applied Chemistry，

Chinese Academy of Sciences， Changchun 130022， China）

AbstractThe monitoring of total toxicity of water is of great importance to guarantee the safety of drinking water and estimate the level of water pollution from multiple pollutants. Here， we reported an online equipment for monitoring toxicity of water， where insite cultured microorganisms were used as the test organism and respiratory inhibition of microorganisms was regarded as the toxicity response. A threeelectrode electrochemical detector was integrated in the equipment， where an array electrode composed of microsized Pt disks， a Ag/AgCl （3 mol/L KCl） electrode and a gold wire were used as the working， reference and counter electrodes， respectively. The average respiratory inhibition ratios obtained with this equipment for 5.0， 10.0， 20.0 mg/L 3，5dichlorophenol （DCP） were 24.4%， 48.9% and 59.2%， respectively. The equipment was further used for continuous online monitoring of the total toxicity of underground water， and successfully showed the toxicity alarm when challenged randomly by toxicity samples containing 5.0 mg/L DCP. The present results suggested the good promise of the equipment in online monitoring of water total toxicity.

KeywordsWater total toxicity； Online detection； Microorganism； Respiratory inhibition.

（Received 25 May 2017； accepted 5 July 2017）

This work was supported by Ministry of Science and Technology of China （Nos. 2016YFA0203200，2013YQ170585）， the National Natural Science Foundation of China （Nos. 21675151，21405148） and the Foundation of Young Scholars of Jilin Province， China （No. 20150520010JH）.endprint