基于萘酰亚胺的生物硫醇探针的合成及对含硫醇氨基酸的检测

郭靖 刘庆文 杜建时 孔祥怡 宋岩 +杨清彪+赵晴 李耀先

摘要合成了以4羟基萘酰亚胺为荧光团，2，4二硝基苯磺酰氧基为特异性识别基团的生物硫醇探针4（2，4二硝基苯磺酰氧基）正丁基1，8萘酰亚胺（DNSBN）。吸收光谱和荧光光谱结果表明， DNSBN对半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）3种生物硫醇分子具有高效的检测识别能力，不受其它17种天然氨基酸的干扰。同时，通过荧光滴定实验证实了此探针是一种比率型探针，555 nm处的荧光强度与溶液中的生物硫醇分子浓度在0 ～ 20 μmol/L范围内呈良好的线性关系，对Cys、Hcy和GSH的检出限（3σ）分别为25.9、92.0和77.9 nmol/L。而吸收光谱、荧光光谱和质谱表征数据显示，生物硫醇与2，4二硝基苯磺酸酯发生亲核取代反应并导致磺酸酯的分解。随着识别基团的解离，探针分子的dPeT （donorexcited photoinduced electron transfer） 效应被解除，并出现非常明显的比色与荧光变化。HeLa细胞成像实验表明，探针DNSBN具有良好的生物相容性，能够对细胞外源性生物硫醇分子进行检测。

关键词荧光探针； 萘酰亚胺； 半胱氨酸； 同型半胱氨酸； 谷胱甘肽

1引 言

生物硫醇（包括半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽）是与人体健康息息相关的重要物质，其含量出现异常时，就会产生某些疾病。例如肝损伤、浮肿、头发脱色或儿童生长缓慢，都与体内半胱氨酸（Cys）含量异常有关[1～3]；血清中同型半胱氨酸（Hcy）是心脑血管疾病的一种标志物[4，5]，老年人的髋骨骨折和阿尔兹海默病等疾病也被认为与其密切相关[6～9]；谷胱甘肽（GSH）作为一种重要抗氧化剂，对维持细胞内部的还原环境和保护细胞器免收活性氧（ROS）的损害起着重要作用[10]。目前，生物硫醇检测已经成为某些疾病诊断的重要依据。

传统的分析检测生物硫醇的方法如高效液相色谱法[11～13]、质谱法[14]、毛细管电泳法[15]、比色分析法[16～18]、电化学分析法[19]等，虽然具有检出限低、重现性好、精确度高等优点，但也存在一些明显的缺陷，如检测成本高、预处理复杂、难以用于体内检测等，限制了其进一步的发展和应用。有机荧光传感器由于操作简单、能够实时检测及可用于体内检测等优势，近年被广泛用于生物、医疗和环境检测领域。目前，针对生物硫醇检测的荧光探针可以分为反应型荧光探针与配位络合型荧光探针两类，主要通过迈克尔加成[20]、醛的环化[21]、二硫键的断裂[22]或其它识别机理[23，24]进行识别。但这些探针大都存在检测限较高、不能在中性环境中使用以及合成复杂等问题。近年来，以2，4二硝基苯磺酰氧基/胺基为识别基团的荧光探针引起了研究者的关注[25，26]。该类探针利用硝基的强吸电子作用，使探针分子在激发态时出现dPeT （Donorexcited photoinduced electron transfer） 效应，从而引起熒光淬灭。而生物硫醇的引入导致分子内的苯磺酰氧基/胺基的离去，dPeT效应被抑制，荧光团的固有荧光得以发射。这类探针具有合成简单、检测限低、灵敏度高等优点，具有很好的实际应用价值。

本研究计合成了以萘酰亚胺为荧光团、2，4二硝基苯磺酰氧基为识别基团的比率型生物硫醇荧光探针4（2，4二硝基苯磺酰氧基）正丁基1，8萘酰亚胺 （4（2，4Dinitrophensulfonyloxy）nbutyl1，8Naphthalimide， DNSBN），实现了中性环境下对生物硫醇的检测，Cys、Hcy和 GSH的荧光检出限分别为2.59×10

Symbolm@@ 8 mol/L、9.20×10

Symbolm@@ 8 mol/L和7.79×10

Symbolm@@ 8 mol/L，并具有很好的细胞成像检测能力。

2实验部分

2.1仪器与试剂

AV400（MHz）型核磁共振波谱仪（美国Bruker公司）：Agilent1290micrOTOF Q II型液相色谱质谱分析仪（美国Agilent公司）； F4500荧光光谱仪， U3010紫外可见吸收光谱仪（日本日立公司）；IX71F22FL型荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）。

N2羟乙基哌嗪N′ 2乙磺酸（HEPES）和N乙基顺丁烯二酰亚胺（NEM）（分析纯，阿拉丁（上海）试剂有限公司）；2，4二硝基苯磺酰氯和谷胱甘肽（分析纯，萨蒽化学技术（上海）有限公司）；半胱氨酸（分析纯，98.5%，国药集团化学试剂有限公司）；同型半胱氨酸（分析纯，95%，SigmaAldrich公司）；无甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、赖氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬胺酸和苏氨酸（分析纯，北京百灵威科技有限公司 （J&K Chemical））；DMEM细胞培养基（ThermoFisher Scientific 公司）；其它试剂均为国产分析纯。

2.2实验方法

2.2.1探针DNSBN的合成中间体1、2和NIOH按照文献[27]的方法合成，如图1所示： 在100 mL圆底烧瓶中，加入20 mL无水四氢呋喃、0.45 g（1.67 mmol）NIOH和350 μL（2.5 mmol）三乙胺，0℃下搅拌15 min，随后缓慢滴加含有0.49 g（1.84 mmol）2，4硝基苯磺酰氯的15 mL无水四氢呋喃，室温搅拌5 h，加2 mL水淬灭反应，减压蒸干溶剂，洗涤、抽滤，真空干燥，将得到的粗产物用二氯甲烷/石油醚（3∶1， V/V）柱层析洗脱分离，得到0.54 g淡黄色的探针DNSBN，产率64.7%。1H NMR （400 MHz， d6DMSO） δ 9.17 （d， J=2.2 Hz， 1H）， 8.62 （dd， J=8.7， 2.2 Hz， 1H）， 8.56 （d， J =7.2 Hz， 1H）， 8.47 （d， J=8.1 Hz， 1H）， 8.38 （d， J=7.3 Hz， 1H）， 8.36 （d， J=8.5 Hz， 1H）， 7.95 （t， J=7.9 Hz，endprint

2.2.2测试前溶液的配制以及测试参数配制5 × 10

Symbolm@@ 3 mol/L DNSBN的乙腈溶液，储存于冰箱中，各种氨基酸和谷胱甘肽各自配制成0.01 mol/L的溶液 （20 mmol/L HEPES缓冲液，pH=7.4），低温保存。移取DNSBN原液用pH=7.4的乙腈HEPES（1∶1，V/V）缓冲液稀释浓度为1.0 × 10

Symbolm@@ 5 mol/L，用于DNSBN对各种氨基酸的比色与荧光的裸眼识别测试。移取0.5 mL DNSBN原液，并用pH=7.4的乙腈HEPES（1∶1，V/V）缓冲液稀释至5.0 × 10

Symbolm@@ 6 mol/L的DNSBN溶液，用于探针的荧光发射光谱测试。激发波长为456 nm，激发与发射狭缝均为5 nm。各待检测物与探针的作用时间均为90 min，温度为室温（25℃）。

2.2.3细胞培养与细胞成像实验参照文献[29]方法，在37℃，5% CO2的气氛中，HeLa细胞在含有10%（V/V）胎牛血清 （FBS）的DMEM 培养基中培养。在细胞成像前，HeLa细胞接种在24孔板中并孵育24 h，向一部分HeLa细胞加入2 μmol/L探针并孵育30 min；用HEPES缓冲液清洗细胞3次。用荧光显微镜观察，暗场下HeLa细胞发出黄绿色荧光。另一部分HeLa细胞在加入2 μmol/L探针前，先用5 mmol/L N乙基马来酰亚胺（NEM，生物硫醇抑制剂）预处理30 min，荧光显微镜下发现细胞的荧光强度明显减弱。由此证实了活细胞内部存在大量的生物硫醇。向已被NEM处理的含有荧光探针的HeLa细胞中再分别加入40 μmol/L 半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽，37℃下继续孵育1 h，用HEPES缓冲液清洗3次，并用荧光显微镜进行细胞成像观察。

3结果与讨论

3.1探针DNSBN对生物硫醇的裸眼识别

向10 μmol/L DNSBN溶液中分别加入200 μmol/L的19种氨基酸以及谷胱甘肽，观察探针溶液的比色与荧光变化情况（图2）。结果表明，加入半胱氨酸、同型半胱氨酸和谷胱甘肽后，溶液由无色变为黄色，并在365 nm紫外光下发出强烈的黄绿色荧光；而加入另外17种氨基酸时，溶液未出现明显变化。

3.2探针的紫外可见吸收滴定实验

向DNSBN溶液中分别加入不同浓度的生物硫醇，得到DNSBN对Cys、Hcy和GSH的紫外可见吸收滴定曲线。当3种生物硫醇的浓度分别从0增加到500 μmol/L时，吸收光谱均在450 nm处出现明显的吸收峰；以生物硫醇浓度为横坐标，（A/A0-1）为纵坐标（A 为450 nm处吸收峰强度，A0为未加入生物硫醇时吸收峰强度），结果如图3所示。在检测Cys时，当Cys浓度增加到200 μmol/L后，峰强度达到稳定值；GSH则在250 μmol/L以上浓度时，吸收峰强度达到稳定值；Hcy在300 μmol/L以上，450 nm处吸收值达到稳定值。上述结果说明，在相同条件下，3种氨基酸与探针反应的活性略有差异，依次为Cys>GSH>Hcy。

3.3熒光滴定实验

考察溶液pH值对DNSBN探针与生物硫醇分子反应的荧光强度的影响，结果如图4所示，当pH<4.5时，无论生物硫醇加入与否，探针的荧光强度均很弱，这可能是由于溶液酸性过大，不利于巯基亲核反应的进行；当pH>4.5，随着溶液pH值增加，DNSBN溶液的荧光强度逐渐增加；

对于Cys和GSH，溶液pH值达到7.0后，再增大pH值，荧光强度不再出现明显变化。而对于Hcy，当溶液pH值达到9.0后，荧光强度才不再明显增大。以上现象说明，Cys与GSH的巯基性质比较接近，Hcy的巯基有所不同，推测认为同型半胱氨酸中巯基的性质比较类似于羧基，因此在碱性条件下检测Hcy才更为有利。同时，当溶液的pH>8.0后，即使不加入生物硫醇，探针的荧光强度也明显增强，说明探针在强碱性环境下苯磺酸酯基会发生分解。因此，检测3种生物硫醇的合适pH范围为6.0～8.0，考虑到人体生理pH=7.35～7.45，因此后续测试时pH值选择pH=7.4。

在5 μmol/L DNSBN溶液中逐渐加入3种生物硫醇（每次增加浓度均为2.5 μmol/L），分别得到DNSBN对Cys、Hcy和GSH的荧光滴定曲线，如图5所示。随生物硫醇浓度逐渐增加，探针在555 nm处的荧光强度逐渐增大；在相同浓度时，Cys对探针溶液的荧光强度影响最大。上述实验结果进一步说明探针与Cys的反应活性最强，这与吸收光谱的实验结果一致。

5 μmol/L， 20 mmol/L HEPES （pH 7.4）ACN （1∶1， V/V）， λex=456 nm， 狭缝： 5 nm/5 nm。

Fig.5Fluorescence intensity of DNSBN in buffer solution with the increasing of Cys （A）， Hcy （B） or GSH （C）， the internal graph exhibits that fluorescence intensity of DNSBN at 555 nm with the increasing of biothiols. Concentration of DNSBN is 5 μmol/L； 20 mmol/L HEPES （pH 7.4）ACN （1∶1， V/V）. λex=456 nm， slit width： 5 nm/5 nm

以图5中的Cys浓度为X轴，对应浓度下的555 nm处荧光强度（I）与未加入生物硫醇时荧光强度（I0）的比值（I/I0）作为Y轴，得到Cys荧光滴定曲线的散点图（图6），从图6A可见，Cys浓度在25.9 nmol/L～20 μmol/L浓度范围内，I/I0与Cys浓度有很好的线性关系，回归方程为Y =3.50324 X + 5.13217，线性相关系数R2=0.9916，检出限（3σ）为25.9 nmol/L。如表1所示，本方法的检出限明显低于一些文献报道的探针[28，32]。 同样，根据图6B与6C，得到检测Hcy和GSH的线性回归方程分别为Y=1.44533X + 2.26647和Y=1.70686X + 5.42335，线性相关系数R2分别为0.9974与 0.9921，线性范围分别为92.0 nmol/L～20 μmol/L和77.9 nmol/L～20 μmol/L，检出限分别为92.0 和77.9 nmol/L。endprint

3.4探針的选择性和竞争性实验

为进一步确认DNSBN对检测异生物硫醇的特性，采用紫外可见吸收光谱和荧光光谱考察了探针对19种氨基酸以及谷胱甘肽的响应情况。结果表明，除Cys、Hcy或GSH 3种生物硫醇分子外，10倍浓度的其它氨基酸对吸收光谱以及荧光光谱没有明显影响。对于紫外可见吸收光谱，引入生物硫醇后，350和450 nm处出现两处非常明显的吸收峰，而其它17种干扰性氨基酸则不会引起上述变化（图7A）。

荧光光谱实验表明（图7B），向DNSBN溶液中加入其它氨基酸后，荧光强度几乎没有变化。只有加入3种生物硫醇分子后，555 nm处的荧光才出现明显增强，这进一步证实了DNSBN对生物硫醇有选择性。向探针溶液中引入各种干扰氨基酸（Hcy与GSH的浓度为100.0 μmol/L，其它氨基酸浓度为1.0 mmol/L）的同时，再加入100.0 μmol/L Cys，发现即使在高浓度干扰氨基酸存在下，DNSBN依然对半胱氨酸具有良好的识别能力（图7C）。

3.5探针的识别机理

为了确定探针DNSBN与生物硫醇反应后的产物，分别对DNSBN与Cys、Hcy和GSH的反应产物进行质谱表征，均出现m/z 270.1的碎片峰（图8A）。对检测后所得溶液与NIOH的吸收光谱与发射光谱进行了比对（图8B），峰型基本吻合，

spectra of DNSBN treated with biothiols and NIOH而NIOH的分子离子峰也是m/z 270.1，由此初步证实探针DNSBN与生物硫醇反应后转化为NIOH。结合文献[25，33]的结果，推测加入生物硫醇后，硫醇上的巯基与识别基团2，4二硝基苯磺酸酯键发生亲核取代反应，酯键断裂分解，DNSBN转化为NIOH。实验中发现，由于反应前分子内存在强吸电子基团——硝基， 致使激发态的DNSBN分子出现dPeT （Donorexcited photoinduced electron transfer） 效应，荧光团萘酰亚胺的荧光发射被抑制；而加入生物硫醇后，探针的dPeT效应被抑制，萘酰亚胺的荧光得以发射，溶液出现明显的荧光增强现象。探针的识别机理如图 1所示。

3.6探针的细胞成像实验

文献[34]已经证实，活细胞内存在大量的GSH与Cys，细胞内浓度分别为1～10 mmol/L和30～200 μmol/L。因此，在细胞成像实验中，需要使用生物硫醇抑制剂N乙基顺丁烯二酰亚胺 （NEM） 对HeLa细胞进行预处理[35，36]，随后再加入探针和生物硫醇进行荧光成像。如图9所示，经过NEM处理后的HeLa细胞，加入荧光探针未发出很强的荧光，而加入Cys、Hcy和GSH后，暗场下可以看到细胞发出明显的黄绿色荧光；而从明场下的实验图片可见，HeLa细胞的边缘轮廓完整，细胞形态正常，从而证实DNSBN的细胞毒性很小，可以在活细胞内对外源引入的生物硫醇进行细胞成像。

4结 论

本研究以萘酰亚胺为荧光团、2，4二硝基苯磺酰氧基为识别基团，设计合成了对生物硫醇（Cys、Hcy和GSH）有特异性荧光和比色双重检测性能的染料探针DNSBN。此探针利用生物硫醇能够与2，4二硝基苯磺酸酯发生反应生成硫醚，dPeT效应被抑制，使萘酰亚胺发出其固有荧光，实现了在中性环境中对生物硫醇的高效特异性检测，有望在特定疾病检测和细胞和体内成像中得到应用。

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Synthesis of Naphthalimidebased Biothiols Probe and

Detection of Amino Acids Containing Sulfhydryl Groups

GUO Jing1，2， LIU QingWen2， DU JianShi1， KONG XiangYi1， SONG Yan2，

YANG QingBiao2， ZHAO Qing*1， LI YaoXian2

1（Department of Neurology， ChinaJapan Union Hospital of Jilin University， Changchun 130033， China）

2（College of Chemistry， Jilin University， Changchun 130021， China）

AbstractA novel probe （DNSBN） towards biothiols on the basis of 4hydroxynaphthalimide as fluorophores and 2， 4dinitrobenzenesulfonyloxy group as specific recognition site was designed and synthesized. The result of absorption and fluorescence spectral analyses indicated that the probe had high sensitivity and selectivity towards cysteine （Cys）， homocysteine （Hcy） and glutathione （GSH）， and the detection was not affected by other 17 kinds of natural amino acids. Meanwhile， it was confirmed that DNSBN was a ratiometric probe through the fluorescence titration experiment， and the fluorescent intensity at 555 nm had a high linear relationship with biothiols concentration in the range of 0-20 μmol/L. The detection limits （3σ） of Cys， Hcy and GSH were 25.9， 92.0 and 77.9 nmol/L， respectively. The absorption， emission and mass spectra indicated that biothiols could be engaged in nucleophilic substitution reaction with 2，4dinitrobenzenesulfonate， which induced the sulfonic esters decomposed. With the departure of receptor unit， the dPeT progress （donorexcited photoinduced electron transfer） was blocked with an obvious colorimetric and fluorescence change. Finally， HeLa cell imaging experiments verified that DNSBN had good biocompatibility and could be used to detect exogenous biothiols.

KeywordsFluorescent probe； Naphthalimide； Cysteine； Homocysteine； Glutathione

（Received 19 May 2017； accepted 20 July 2017）endprint