基于石墨烯分子印迹电化学传感器测定芦丁

谢 丹， 龙立平， 刘 蓉， 钟桐生， 李 媛， 唐桥亭

(湖南城市学院材料与化学工程学院,湖南益阳 413000)

芦丁(Rutin)是一种存在于多种植物的茎和根中的黄酮类化合物，在保持和恢复毛细血管正常性方面具有显著功效，常用于防治脑血管出血、视网膜出血、辅助治疗高血压病[1]等。关于芦丁的电化学行为及分析应用方法较多，如反相高效液相色谱法[2]、薄层扫描法[3]、毛细管电泳法[4]、分光光度法[5]等。相比常用检测方法，分子印迹聚合物因性质稳定、成本低、制备简单和选择性识别高等优点展现了良好的应用前景。分子印迹传感器[6 - 7]具有选择性好、灵敏度高、价格低廉等优点，因而备受青睐。Behzad等[8]用多壁碳纳米管分子印迹膜修饰电极测定了芦丁的含量。

石墨烯(GR)是单层原子厚度的石墨[9 - 10]，具有二维蜂窝状网络结构，常温下其电子迁移率极高，导电性能极好，是很好的纳米导电材料。GR修饰电极是电化学分析领域的一个重要研究方向，得到广泛的关注。孙伟等[11]利用电化学方法依次将纳米Au和GR电沉积在离子液体修饰碳糊电极(CILE)表面，制备了对芦丁具有特异性识别功能的修饰电极(GR/Au/CILE)，电极表面纳米Au和GR的存在极大提高了电极的电化学性能。

本文采用滴涂法将GR修饰在Au电极表面，利用循环伏安法(CV)和差分脉冲伏安法(DPV)对所修饰的Au电极进行电化学表征。分析结果显示GR修饰的Au电极与裸Au电极相比具有信号更灵敏等优点，所以将其用于电化学传感器的制备。通过多次实验，对模板分子洗脱、吸附时间进行了优化，并采用CV法和DPV法实现了对芦丁的检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI660D电化学工作站(上海辰华仪器有限公司),三电极系统:Au电极为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极；pHS-3E酸度计(上海日岛科学仪器有限公司)；KQ-500DE数控超声波清洗器(昆山市超市仪器有限公司)；FA2004电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)。

GR(90%,南京纳米材料科技有限公司)；芦丁(98%,南京泽朗植提技术有限公司)；槲皮素(98%,南京泽朗植提技术有限公司)；N,N-二甲基甲酰(DMF，分析纯)；HNO3、NaOH、H2SO4、K3[Fe(CN)6]、K4[Fe(CN)6]、KCl、邻氨基酚和无水乙醇均为分析纯且不再提纯。实验用水为二次蒸馏水。

黑茶(800 g茯砖，湖南益阳茶厂有限公司)。

1.2 GR修饰Au电极的制备

将Au电极在麂皮上依次用1.0、0.3、0.05 μm 的Al2O4抛光，并依次于HNO3(1+1)、无水乙醇、二次蒸馏水中各浸泡5 min。 在0.5 mol/L H2SO4中于-0.2～+1.5 V 进行CV处理，直至获得稳定的CV曲线。称取5.0 mg GR分散于10 mL DMF中，超声60 min 后形成0.5 mg/mL 均匀分散液，取上述分散液5 μL 滴涂于处理好的Au电极表面，在红外灯下烘干得到GR/Au电极。再将电极浸入到分子印迹聚合物溶液中进行CV扫描，扫描30圈后制得分子印迹膜(MIP)修饰电极MIP/GR/Au，在室温下晾干，最后将修饰电极浸入乙醇溶液(1∶1，V/V)中洗脱7 min，去除模板分子后将电极洗净晾干，得到芦丁分子印迹传感器。

1.3 实验方法

CV法电位范围为-0.1～+0.5 V，扫速为0.05 V/s；DPV法电位范围为-0.1～+0.5 V，电位增量0.004 V，振幅0.05 V，脉冲周期0.5 s，脉冲宽度0.2 s，采样宽度0.0167 s，静置时间2 s。本实验均以0.50 mol/L KCl为支持电解质在5.00×10-3mol/L的[Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行电化学表征。

2 结果与讨论

2.1 GR修饰Au电极的电化学表征

图1为裸Au电极与GR/Au电极在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的CV图。 由图可知，裸Au电极(曲线a)与GR/Au电极(曲线b)在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中，在-0.1～+0.5 V之间有一对明显的氧化还原峰，GR/Au 电极(曲线b)的氧化峰电流Ip=-50.43 μA，较Au电极(曲线a)氧化峰电流Ip=-40.19 μA增加了大约10 μA ，这可能是因为GR分子所具有几何立体结构和特定基团为反应提供了较多的空间位点，这样有利于电极对[Fe(CN)6]3-/4-的富集吸附，并且加快了电子传递速率，使其表面导电性增强，峰电流明显变大，从峰电流的增大可以看出GR修饰的Au电极具有很好的增敏效果。

2.2 GR修饰电极的电聚合分子印迹膜

GR修饰的Au电极晾干后在浓度比为12∶1的1.00×10-3mol/L邻氨基酚和8.40×10-5mol/L芦丁混合液中电聚合，pH值为5.5，在扫速为0.05 V/s下进行CV扫描。如图2所示，扫描30圈的过程中，随着扫描圈数的增加电流逐渐下降，最后在电极表面形成了一层致密的分子印迹膜，阻止了电子的传递。

图1 Au电极和GR/Au电极在5.00×10-3 mol/L[Fe(CN)6]3-/4- 溶液中的CV曲线Fig.1 CV curves of Au and GR/Au electrodes in 5.00×10-3 mol/L [Fe(CN)6]3-/4- solution supporting electrolyte:0.50 mol/L KCl;scan rate:0.05 V/s.a:Au electrode;b:GR/Au electrode

图2 GR/Au电极在1.00×10-3 mol/L邻氨基酚和8.40×10-5 mol/L芦丁混合液中电聚合CV曲线Fig.2 CV curves of GR/Au electrode in mixed solution of 1.00×10-3 mol/L o -aminophenol and 8.40×10-5 mol/L rutin scan rate:0.05 V/s.

2.3 模板分子洗脱时间的选择

Au电极镀膜后以乙醇溶液(1∶1，V/V)洗脱模板分子芦丁，再以5.00×10-3mol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液和0.50 mol/L KCl为电解质的混合溶液中用DPV法测定峰电流大小。 如图3所示：在0～7 min 范围内，模板分子被洗脱，聚合膜上的孔穴也随之增多，峰电流逐渐增大，至7 min 处电流达到最大，随后当洗脱时间由7 min 延长至8 min 时，峰电流不再增加，并达到稳定，故选择7 min 为最佳洗脱时间。

2.4 模板分子印迹时间的选择

在Au电极镀膜后以乙醇溶液(1∶1，V/V)洗脱7 min。将洗脱后的分子印迹膜电极在pH约为5.5、浓度为1.00×10-4mol/L 的芦丁溶液中印迹，在5.00×10-3mol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液和0.50 mol/L KCl为电解质的混合溶液中用DPV法测定峰电流大小。如图4所示：印迹时间0～12 min 范围内，随着印迹时间的延长，分子印迹膜上印迹上的模板分子越来越多，孔穴越来越少，峰电流逐渐变小，至12 min 处峰电流达到最小，随后当印迹时间由12 min 延长至15 min 时，峰电流不再减小，达到并趋于稳定。故选择12 min 为最佳印迹时间。

图3 洗脱不同时间后的MIP/GR/Au电极在5.00×10-3 mol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的DPV曲线Fig.3 DPV curves of MIP/GR/Au electrode in 5.0×10-3 mol/L [Fe(CN)6]3-/4- solution with different elution time supporting electrolyte:0.50 mol/L KCl;scan rate:0.05 V/s.a-i:0,1,2,3,4,5,6,7,8 min.

图4 吸附不同时间后的MIP/GR/Au电极在5.00×10-3 mol/L [Fe(CN)6]3-/4-溶液中的DPV图Fig.4 DPV curves of MIP/GR/Au electrode in 5.00×10-3 mol/L [Fe(CN)6]3-/4- solution with different adsorption time supporting electrolyte:0.50 mol/L KCl;scan rate:0.05 V/s.a-f:0,3,6,9,12,15 min.

2.5 分子印迹膜电化学响应曲线

图5 印迹不同浓度芦丁的MIP/GR/Au电极的差分脉冲伏安曲线；插图为校准曲线Fig.5 DPV curves of MIP/GR/Au electrode rebinding with rutin of different concentration;Insert is the calibration curves of peak current vs rutin concentration a-i:4.4,8.8,18,26,35,70,140,210,280 μmol/L.

在最优条件下，对不同浓度的芦丁进行测定。结果表明[Fe(CN)6]3-/4-的峰电流值与芦丁浓度在4.40×10-6～2.80×10-4mol/L范围内呈良好的线性关系，峰电流随其浓度的增加而减小。如图5所示，其线性方程为:I(μA)= 7.115lgc(mol/L)+5.051，线性相关系数R为0.9955，检测限为1.46×10-6mol/L。

2.6 干扰实验

在最优实验条件下，选取与芦丁结构相似的槲皮素和桑色素作为干扰物质，考察芦丁分子印迹传感器对芦丁分子的选择性。在浓度为1.00×10-5mol/L的芦丁溶液中将具有印迹孔穴的分子印迹传感器浸泡其中，实验表明15 min 后峰电流明显减小，这说明芦丁能够被印迹膜的分子空穴识别，同样将此传感器先后放入1.00×10-5mol/L溶度的桑色素和槲皮素溶液中，两者的峰电流基本不发生变化，根据允许干扰量为引起峰电流改变量 ±10.0%进行计算，10倍槲皮素和15倍桑色素不干扰芦丁含量的测定。表明此传感器对芦丁具有较好的选择性。

2.7 样品的测定

称取5.00 g 黑茶3份，分别放入250 mL 的圆底烧瓶中，加95%乙醇100 mL回流60 min，过滤后离心，调节其pH值为5.5，按上述条件测定，得到峰电流值，通过标准曲线，计算出芦丁的含量并进行加标回收率测定，其结果如表1所示。该分子印迹传感器的回收率为96.8%～104.0%，其相对标准偏差(RSD)小于2.5%。

表1 样品测定结果和回收率(n=5)Table 1 Determination results of samples and recoveries(n=5)

3 结论

采用滴涂法将GR修饰在Au电极表面，用CV法和DPV法对修饰的Au电极进行电化学表征，研究结果表明GR修饰的Au电极性能稳定，信号更灵敏，可将其用于传感器的制备。进一步在GR修饰的Au电极表面电聚合制备具有特异性识别孔穴的芦丁分子印迹敏感膜，在最佳实验条件下，实现了该传感器对芦丁的检测，检测限为1.46×10-6mol/L。