QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法测定植物源性 食品中噻氟隆和炔草隆残留

周 均， 粟有志， 李 芳， 辛 芳， 陆 平， 谢丽琼

(1.伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心，新疆伊宁 835000； 2.伊犁师范学院化学与环境科学学院，新疆伊宁 835000； 3.新疆大学生命科学与技术学院，新疆乌鲁木齐 830046)

图1 噻氟隆和炔草隆的化学结构式Fig.1 Structural formula of thiazafluron and buturon

噻氟隆(Thiazafluron)又名赛唑隆，化学名称为1,3-二甲基-l-(5-三氟甲基-1,3,4-噻二唑-2-基)脲，它是一种内吸性杂环脲类除草剂，主要用于去除棉花、玉米耕地中一年生和多年生的单子叶和双子叶杂草[1]。炔草隆(Buturon)又名播士隆，化学名称为1-甲基-l-(1-甲基丙炔-2-基)-3-(4-氯苯基)脲，一种苯基脲除草剂，主要用于农作物芽前和苗后的阔叶及一年生杂草的控制[2]。噻氟隆和炔草隆结构见图1。研究表明，此类除草剂对人类有不同程度的毒性，甚至有致癌作用[3]。目前关于噻氟隆检测方法的报道较少，仅见彭兴等[4]建立的水果蔬菜中噻氟隆的液相色谱-飞行时间质谱法的定性筛查方法；关于炔草隆的检测方法，主要有液相色谱法[5 - 6]、液相色谱-串联质谱法[7 - 8]、液相色谱-飞行时间质谱法[9 - 10]。QuEChERS技术是一种简单、快速、廉价、高效、耐用、安全的样品前处理方法，已广泛用于食品中农药残留的检测[11 - 13]。

本研究采用改进的QuEChERS前处理方法，结合高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)建立了同时分析植物源性食品中噻氟隆和炔草隆残留的方法。该方法简便快捷，精密度和回收率较好，适用于植物源性食品中噻氟隆和炔草隆残留的快速确证和定量分析。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

1260-6460A液相色谱-串联质谱仪(美国，Agilent公司)；Sigma3-18K台式冷冻离心机(美国，Sigma公司)；EYELA MMV-1000W振荡器(日本，东京理化公司)；GM 200刀式混合研磨仪(德国，Retsch公司)；MS3型涡旋振荡器(德国，IKA公司)。

噻氟隆(纯度99%)、炔草隆(纯度98.5%)标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司，乙腈、甲醇、丙酮、甲酸、乙酸乙酯、乙酸、正己烷均为色谱纯(德国，Merck公司)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)粒径40～60 μm、苯磺酸化聚苯乙烯/二乙烯苯(PCX)粒径40～60 μm、聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)粒径70～90 μm(美国Agela公司)；酸性氧化铝(ALA)、石墨化碳黑(GCB)和C18、氨基(NH2)粉(美国Agilent公司)。实验用水为MiIIi-Q Advangtage A10 超纯水系统(美国，Millipore公司)制备。

分析样品为实验室送检和市售样品。

1.2 标准溶液的配制

标准储备溶液：称取标准品噻氟隆和炔草隆各10 mg(精密称定)，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液，于4 ℃冰箱中储存。基质匹配标准曲线的配制：称取样品约2.5 g(精密称定)，按照1.3节样品前处理和1.4节仪器条件进行分析，当噻氟隆和炔草隆的定性定量离子信噪比均小于3时，样品确定为空白基质；空白基质按照1.3节前处理，获得基质空白提取液，逐步用基质空白提取液将标准储备液稀释至相应的工作浓度。

1.3 样品前处理

白菜、葡萄、西红柿、黄瓜等新鲜果蔬取其可食部分，切碎混匀，用混合研磨仪制成匀浆备用。葡萄干、枸杞样品先置于-20 ℃冰箱放置6 h以上，将样品中水分冻成固态冰，迅速取出样品用混合研磨仪加工成粉末状备用。大米和小麦粉样品用粉碎机粉碎成粉末状备用。

葡萄、西红柿、白菜、苹果、黄瓜等新鲜果蔬样品：称取2.5 g样品(精确0.01 g)于50 mL具塞离心管，加入5.0 mL酸化乙腈(含0.1%乙酸)，涡旋30 s混匀，加入1.5 g NaCl，震荡15 min，4 500 r/min离心3 min，取上清液1.0 mL于2 mL具塞离心管，加入吸附剂GCB 25 mg，涡旋30 s，6 000 r/min离心3 min，取上清液过0.22 μm尼龙膜，滤液待测。枸杞、大米、葡萄干及小麦粉等含水量较少样品：称取2.5 g样品(精确0.01 g)于50 mL具塞离心管，加入5.0 mL超纯水浸泡30 min，加入5 mL酸化乙腈，涡旋30 s，加入2.5 g NaCl，震荡15 min，4 500 r/min离心3 min，取上清液1.0 mL于2 mL具塞离心管，加入吸附剂GCB 25 mg，涡旋30 s，4 000 r/min离心3 min，取上清液过0.22 μm尼龙膜，滤液待测。

1.4 HPLC-MS/MS条件

色谱条件：色谱柱：JADE-PAK CB-C18柱(100×2.1 mm,3 μm)；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。流动相：A相为甲醇，B相为0.1%甲酸溶液(含5 mmol/mL乙酸铵)，流速为0.25 mL/min。梯度洗脱程序如下：0～1.5 min,0%～65%A;1.5～6.5 min,65%～90%A;6.5～8.5 min,90%A;8.51～10 min,10%A。

质谱条件：电喷雾正离子模式(ESI+)；多重反应监测(MRM)；干燥气温度：300 ℃；干燥气流量：10 L/min；鞘气温度：250 ℃；鞘气流速：9 L/min；毛细管模式电压4 000 V；监测离子对、碰撞能量、碎裂电压等见表1。

表1 炔草隆和噻氟隆的质谱分析参数Table 1 Mass spectrometric conditions of the pair ion for buturon and thiazafluron

*Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

分别采用ESI+和ESI-对噻氟隆和炔草隆进行母离子扫描，结果表明两者均较适合采用ESI+模式，从而确定噻氟隆的[M+H]+为m/z241.1，炔草隆的[M+H]+为m/z237.1。进一步对子离子、碎裂电压、碰撞能量等参数进行优化，获得噻氟隆和炔草隆的二级质谱全扫描图见图2。参照欧盟指令657/2002/EEC决议中有关规定，本文选择离子丰度最高、本底干扰最小的两个离子对作为特征离子对，其中信号较大的离子对作为定量离子。优化后的质谱参数详见表1。

图2 噻氟隆和炔草隆的子离子扫描质谱图Fig.2 MS2 spectra of product ion scan for buturon and thiazafluron

液相色谱-质谱法分析样品时，若选择ESI+模式，在流动相中加入微量的甲酸可提供离子化所需要的H+，微量的乙酸铵可以减少[M+Na]+离子的形成，从而提高监测离子的灵敏度。本研究比较了乙腈、甲醇组成的有机相(A相)，以及不同浓度甲酸溶液、乙酸铵溶液、甲酸和乙酸铵混合溶液、纯水所组成的无机相(B相)，通过A相与B相的组合比较分析发现，以甲醇-0.1%甲酸溶液(含5 mmol/L乙酸铵)为流动相时，噻氟隆和炔草隆的离子化效率较高。

2.2 前处理条件的优化

图3 不同提取溶剂对噻氟隆和炔草隆的提取效率Fig.3 Extraction efficiencies of thiazafluron and buturon with different solvents

以枸杞为分析样品，比较乙腈、酸化乙腈(含0.1%乙酸)、正己烷、乙酸乙酯、丙酮五种提取剂对噻氟隆和炔草隆的提取效果。结果(图3)表明：采用丙酮、正己烷、乙酸乙酯作为提取剂时，回收率不能满足要求；乙腈和酸化乙腈提取时，回收率在85%～100%，均可满足分析要求。分别以乙腈和酸化乙腈提取空白样品，获得空白样品提取液，以空白样品提取液稀释纯溶剂标准溶液，获得相同浓度的基质标准溶液和纯溶剂标准溶液，分析样品基质对噻氟隆和炔草隆的影响，结果表明乙腈提取时噻氟隆和炔草隆的基质效应分别为66.5%和81.5%；而0.1%乙酸乙腈提取噻氟隆和炔草隆的基质效应分别为71.7%和86.1%。因此，最终确定酸化乙腈(含0.1%乙酸)作为提取剂。

选择QuEChERS前处理样品，常选择GCB去除花青素、叶绿素等色素化合物，PSA去除有机酸，C18去除脂肪和脂类等非极性有机物。以富含色素的枸杞为分析样品，比较了PSA、C18、PCX、PEP、NH2、ALA、GCB 7种吸附剂对样品的净化效果。结果表明：C18净化后，噻氟隆的回收率仅为62%；而其他6种吸附剂净化后，噻氟隆和炔草隆的回收率均在80%～100%，均可满足分析方法学的要求。通过比较不同吸附剂净化后，噻氟隆和炔草隆的基质效应，结果发现使用GCB净化后，样品的基质干扰相对较小。同时GCB净化后，样品提取液较为清澈。故本文选择GCB净化样品。进一步确定GCB的用量。当吸附剂用量为25、50、75、100 mg 时，对比噻氟隆和炔草隆的回收率和基质效应。结果表明，当GCB用量为25～100 mg时，两者的回收率在91.5%～104.7%范围，基质效应为85%～90%，回收率和基质效应均无明显差别，考虑节约成本，最终选择GCB的用量为25 mg。空白枸杞样品和添加1倍定量限(LOQ)噻氟隆和炔草隆的空白样品，经提取和净化后的MRM色谱图分别见图4和图5。

图4 空白枸杞基质中MRM色谱图Fig.4 MRM chromatograms of a blank Chinese wolfberry

图5 空白枸杞中添加1倍LOQ浓度的噻氟隆和炔草隆的MRM色谱图Fig.5 MRM chromatograms of a negative Chinese wolfberry sample spiked with Buturon and Thiazafluron at 1×LOQ concentration level

2.3 基质效应、线性范围、检出限和定量限

采用相对响应值法[14]，评定噻氟隆和炔草隆的基质效应(ME)。根据公式：ME=Am/Ac×100%，其中Am表示空白基质标准响应值；Ac表示纯溶剂标准响应值。当ME在80%～120%之间表明基质效应可以忽略，但ME在50%～80%和120%～150%之间时，需要考虑如何消除基质效应。

从表2可知，样品基质对噻氟隆和炔草隆均有抑制效应，部分基质效应不可忽略，需采用基质匹配标准曲线消除样品基质效应。空白样品按照1.3节方法处理，获得基质空白提取液，逐步用基质空白提取液将噻氟隆标准储备液稀释至0.2、0.4、1.0、2、4、10、20 ng/mL，炔草隆标准储备液稀释至0.5、1、2.5、5、10、25、50 ng/mL。以峰面积(y)对农药质量浓度(x)作线性回归，绘制标准曲线，噻氟隆和炔草隆的相关系数(r2)均大于0.997。噻氟隆和炔草隆线性范围、相关系数详见表2。以信噪比(S/N)=3和S/N=10计算检出限和定量限。噻氟隆的方法检出限为0.1 μg/kg，定量限为0.4 μg/kg；炔草隆的方法检出限为0.3 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg。

表2 噻氟隆和炔草隆的线性范围、基质效应、线性关系Table 2 Linear range,matrix effects,linear relationships (r2) of thiazafluron and buturon

y:peak area;x:mass concentration,ng/mL.

2.4 方法的准确度和精密度

选择葡萄、葡萄干、西红柿、大米、苹果、枸杞、黄瓜、小麦粉、白菜等空白样品，以1、2、10倍LOQ为加标水平进行回收率实验。所有样品添加混合标准溶液后，静置30 min，待农残被样品充分吸收后，按照1.3节方法和1.4节条件进行前处理和仪器测定，每个水平重复6次。由表3可知：噻氟隆的平均回收率为84.7%～107.7%，相对标准偏差(RSD)为4.2%～16.3%；炔草隆的平均回收率为74.7%～110.0%，RSD为4.3%～12.8%。

表3 噻氟隆和炔草隆的加标回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of thiazafluron and buturon(n=6)

2.5 样品测定

利用本方法对市售的9种植物源性食品(葡萄、葡萄干、西红柿、大米、苹果、枸杞、黄瓜、小麦粉、白菜)共计60余份样品进行噻氟隆和炔草隆残留量的监测分析。结果均未检测出目标分析物。

3 结论

本研究以酸化乙腈为提取剂，样品经GCB吸附剂净化，通过色谱和质谱条件的优化，建立了植物源性食品中噻氟隆和炔草隆残留的检测方法。该方法简便快捷、灵敏度高、实用性强，方法学结果满足国家标准(GB/T 27404-2008)《实验室质量控制规范-食品理化检测》的相关要求，适用于植物源性食品中噻氟隆和炔草隆残留的快速确证检测。