分子印迹-流动注射化学发光测定磺胺二甲基嘧啶

向 辉， 谭 利， 袁丝兰， 张罗一览， 郑 红*,2,3

(1.重庆师范大学化学学院，重庆 401331； 2.中国科学院青海盐湖研究所，青海西宁 810008； 3.青海师范大学化学系，青海西宁 810008)

磺胺二甲基嘧啶(Suifamethazine，SM2)是较广泛应用的磺胺类药物之一，其抗菌性强，消炎作用好，广泛用于猪、禽和牛养殖业疾病的预防和治疗[1 - 2]，但是过量食用含SM2的动物组织能导致人的过敏反应，对人类的健康产生极大危害，因此，我国农业部在2002年235号公文中规定动物源性食品中磺胺类总量不得超过0.1 mg/kg[3]。目前，测定磺胺类物质的方法有：酶联免疫方法(ELISA)[4]、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)[5]、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)[6 - 7]、高效液相色谱法(HPLC)[8 - 9]、薄层色谱法[10]等。但是以上方法均存在一些缺点，且测定SM2时很多物质对其测定有干扰，很难用于复杂样品中SM2的测定，因此建立操作方便、适用性强、准确性高的分析方法对SM2的检测有重大意义。

本研究分别以SM2、二乙烯三胺、聚乙二醇、环氧树脂为目标分子、功能单体、溶剂、交联剂，合成了对SM2具有特异性识别的分子印迹聚合物(MIP)，采用HCl-KMnO4-甲醛发光体系，运用流动注射仪学发光技术(FI-CL)，建立了对SM2有特异性识别的MIP-FI-CL分析方法，并成功用于复杂样品中SM2的测定。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

IFFM-D型流动注射化学发光仪(西安瑞迈电子科技有限责任公司)；DKL310C送风定温恒温箱(成都盛德先华科贸有限公司)；PS-20实验室超声波清洗机(巩义市英峪仪器厂)；AL204电子天平(捷久计量衡器有限公司)

SM2标准储备液(1.0×10-3mol/L):称取0.273 g SM2(纯度99%)，超声溶解并定容于1 L容量瓶中备用;HCl(分析纯，西陇化工)；KMnO4溶液(1.0×10-2mol/L);甲醛(分析纯，南京化学试剂股份有限公司)；聚乙二醇1500(PEG)(分析纯，上海研生实业有限公司)；二乙烯三胺(分析纯，上海弘顺生物科技有限公司)；环氧树脂(济南宏博利化工有限公司)。实验用水为二次馏水。

1.2 SM2 MIP的制备

称取聚乙二醇1500(PEG)8 g，水浴溶解，趁热依次加入SM2 0.5 mmol，搅拌，再移取1 mL二乙烯三胺，同样使其混合均匀，最后加入4 g环氧树脂，充分搅拌5 min，再放入超声清洗仪中超声去除混合液中的气泡，得到透明澄清的溶液。趁热倒入一端已密闭的10 mL针筒中后，将另一端也密闭。将此针筒放入60 ℃的烘箱内，在此条件下反应24 h，得到白色固状聚合物。非印迹聚合物(NMIP)的制备除不加标准样品SM2外，其余步骤相同。将柱状MIP聚合物于室温冷却，然后研磨，将研磨后的粉末放于烧杯中，加入蒸馏水，放入超声清洗仪中洗涤10 min，重复以上洗涤步骤数次，直至烧杯中的蒸馏水不再浑浊，则聚乙二醇已被洗尽。将洗涤后的粉末直接放入60 ℃烘箱中烘干，取出干燥已成块状的粉末，研磨过筛，收集粒径为100～150 μm的聚合物粉末。

1.3 SM2 MIP柱的制备

将0.02 g含有SM2的印迹颗粒添加到塑料管中(20×4 mm)，两头用玻璃棉堵住，保证印迹颗粒不被冲走并使流路顺通，将两根内径3 mm、外径为4 mm的软管插入塑料管两端即可。在用此印迹柱之前，将HCl、甲醛和KMnO4溶液同时流经印迹柱，除去柱中的SM2，当混合溶液流经印迹柱时，与柱中的SM2直接反应，产生CL信号，SM2不断被消耗，发光信号渐渐变弱，当信号降至与空白信号相同且不再变化，此时可认为柱中的SM2被洗干净。然后,用水洗去柱中的残留物质以备用。

图1 分子印迹-化学发光分析流路图Fig.1 Schematic diagram of molecularly imprinted chemiluminescence method a:HCl;b:KMnO4;c:formaldehyde;d:water;e:SM2 solution;F:flow cell;P:peristaltic pumb;V:8-way injection valve;HV:negative high voltage;PMT:photomultiplier tube;W:waste solution;AM:amplifier;A/D:digital to analog converter;COM:computer.

1.4 分析步骤

依照图1所示流路检测SM2，其步骤为：(1)SM2的富集。将泵1静止，转动八通阀使其位于e处，泵2运送SM2溶液流过印迹柱，吸附SM2。(2)洗脱除去残余杂质。泵1静止，转动八通阀使其位于d处，泵2运送重蒸馏水流过印迹柱，除去未被吸附的SM2溶液和杂质。(3)化学发光检测。转动八通阀使其位于c处，泵1转动，泵2停止，KMnO4、HCl和甲醛溶液同时流经印迹柱，与吸附在柱子上的SM2发生CL反应。清洗MIP柱。泵1静止，转动八通阀使其位于d处，泵2运送二次蒸馏水流过MIP柱，将柱子上的剩余物洗尽，备用。

2 结果与讨论

2.1 SM2分子印迹聚合物的红外光谱表征

图2 MIP和NMIP红外(IR)光谱图Fig.2 IR spectra of MIP and NMIP

由图2红外光谱可知，NMIP和MIP中1 500 cm-1处出现的强峰为环氧化物的特征峰，在2 600～3 000 cm-1处出现的峰为饱和碳氢键的峰，在3 400 cm-1处出现的宽峰为羟基的特征峰。这些特征峰在NMIP和MIP上同时出现，证明了NMIP和MIP合成成功，且他们的骨架成分相同，而在MIP中单独出现1 528 cm-1的峰是C=N的特征峰，说明MIP柱上成功的吸附了SM2分子。

2.2 MIP柱的尺寸及稳定性

在检测中，将甲醛、HCl与KMnO4同时经过MIP柱，若二者接触太久，得到的信号过低。经实验，采用直型的塑料管(d=4 mm，L=20 mm)，将20 mg SM2 MIP填入即可，将其连入系统中。甲醛、HCl与KMnO4混合，与柱上的SM2反应，得到较强的CL信号。由实验可得，制成的印迹柱重复使用上百次，性能几乎不变。

2.3 化学发光分析条件的优化

2.3.1酸介质和浓度分别以1.2 mol/L的HCl、HNO3、H3PO4、H2SO4为反应介质，测定KMnO4-甲醛-SM2体系的CL强度。结果表明，在HCl中CL信号最强，所以选取HCl为反应介质。选取浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mol/L HCl进行实验，HCl为0.4 mol/L时CL信号最高，故选取0.4 mol/L为HCl最佳浓度。如图3。

2.3.2KMnO4溶液浓度固定其他条件不变，考察了KMnO4浓度对CL强度的影响，如图4。KMnO4溶液浓度在5.0×10.0-5～1.0×10-3mol/L范围内时，可以看出最佳条件是1.0×10-3mol/L。

图3 盐酸浓度对化学发光强度的影响Fig.3 Effect of HCl concentrations on chemiluminescence

图4 高锰酸钾浓度对化学发光强度的影响Fig.4 Effect of KMnO4 concentrations on chemiluminescence

2.3.3甲醛质量分数当KMnO4、HCl、SM2浓度固定不变时，考察不同质量分数甲醛对发光强度的影响。分别选取质量分数为4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%，实验结果表明甲醛质量分数为10%时发光强度最大。

2.3.4吸附时间当溶液浓度相同，装柱量相同时，检测了吸附时间在 20～100 s对CL强度的影响，实验结果显示，对于1.0×10-3mol/L的SM2，在60 s 时，吸附量基本达到饱和，不再随时间的改变而改变。因此，吸附时间定为60 s。

2.3.5化学发光时间甲醛、HCl、KMnO4溶液流经印迹柱时,与印迹柱上的SM2反应,得到增强的CL信号。当其与空白信号一致时,可知柱上的SM2已被彻底消耗。结果表明，结束一个这样的发光过程需时间50 s。

2.4 标准曲线、精密度和检出限

在最佳实验条件下，CL强度与SM2浓度在1.0×10-4～1.5×10-3mol/L范围内呈良好的线性关系，回归方程为：ΔICL=2.35×105c(mol/L)+16.92，相关系数R2为0.9988，检出限是6.0×10-5mol/L。对浓度为0.5×10-3mol/L的SM2平行测定11次，相对标准偏差为1.6%

2.5 干扰实验

2.6 样品分析

在选定的最优化条件下，测定在市面上购买的兽药(含10%SM2)中SM2的含量，测定结果对照标准曲线SM2含量为9.1%。同时做加标实验，称取葡萄糖，NaCl，MgSO4，NH4NO3，KCl各0.1 g于500 mL容量瓶中，再加入适量的SM2标准溶液，二次蒸馏水定容。准确吸取一定体积溶液稀释到线性范围内，按照图1流程，3次平行测定，其回收率见表1。

表1 样品中SM2的测定结果(n=3)Table 1 Results of sample and recovery tests(n=3)

3 结论

本文运用HCl-KMnO4-HCHO发光体系和SM2分子印迹技术联用对复杂样品中的SM2含量进行测定，结果令人满意，方法的加标回收率为95.0%～109.0%。