透射电镜三维重构确定金纳米粒子的立体结构

唐明华, 郭 军, 陈木子

(苏州大学分析测试中心，江苏苏州 215123)

局域表面等离激元是指金属或高掺杂半导体纳米结构中类自由电子在外电磁场激发下，电子运动与电磁场互相激励产生的共谐振荡[1]。具有局域表面等离激元特性的这类金属纳米颗粒，比如金或银，可以把光场聚集或局域到远小于波长的纳米尺度空间内，在生物传感器[2 - 3]、超材料[4 - 5]、纳米光激性回路[6]、光电探测器[7]、太阳能电池[8]、光催化剂[9 - 11]、非线性光学器件[12]等方面具有巨大的应用价值。但金属纳米结构中电子的共谐振荡受制于纳米颗粒几何形状所产生的边界条件，因而为了显著改变颗粒的表面等离激元响应，越来越多的研究者尝试制备合成各类形貌各异、并具有三维空间区域的贵金属颗粒，比如纳米双锥、纳米六角片、纳米多面体(八面体、十六面体、二十四面体等)、纳米星等。这些纳米颗粒具有的特异空间立体结构，比如容易分布着热区的曲率较高的边、尖端等，可提高表面等离激元响应，为催化反应提供更多的表面活性位点、表面增强拉曼、荧光等，但其特异的空间立体结构通过扫描电镜及透射电镜的二维图像并不能真切地观测和确定。

电子断层三维重构技术是将样品沿着一个与电子束垂直的轴向倾转，每倾转一个角度得到一个与物体对应方向的二维图像，通过计算机对这一系列二维图像进行处理，将不同角度的二维图像反向重构出样品的3D结构的技术[13 - 14]。目前，由于电子断层三维重构技术可以对非均质的蛋白复合物、细胞、细胞器及镶嵌在膜上的膜蛋白等原位精细结构进行研究，被广泛地应用到结构生物学及医学领域[15 - 16]，但在纳米材料、化学领域研究中的应用并不广泛。

本文利用Tecnai G2F20场发射透射电镜配置的三维重构附件对两种具有特异空间立体结构的金纳米颗粒进行不同倾转角度下二维图像的采集、图像匹配对中及重构、立体模型构建，进而从最终构建的立体模型及制作的录像(Movie)中可准确获知两种样品的立体空间形貌，尤其是曲率较高的边、尖端的分布等等，从而可以从纳米颗粒几何形状所产生边界条件的不同解释样品表面等离激元特性的差异。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Tecnai G2F20透射电子显微镜(美国，FEI公司)；S-4700扫描电子显微镜(日本，日立公司)；E-1010真空镀膜仪(日本，HITACHI公司)。

实验所用试剂均为分析纯溶剂。

1.2 待测样品制备

实验所用两种金纳米颗粒样品由苏州大学材料与化学化工学部提供。取少量样品放置于盛有少量无水乙醇的1.5 mL离心管中，将离心管放入超声震荡仪中震荡5 min左右，然后用移液枪取分散均匀的样品，分别滴于150目碳支持膜铜网和硅片上，红外灯烘干后，分别于透射电镜(TEM)及扫描电镜(SEM)中观察。

1.3 扫描电镜测试

将制备好的硅片上的样品用导电双面胶粘在样品台上，放入喷金电镀仪里，设置工作电流为15 mA，喷金时间为60 s，进行真空喷镀。将喷镀好的样品放入SEM中观察；SEM工作电压为15 kV，工作电流为10 mA，选择合适的放大倍数聚焦拍照。

1.4 透射电镜测试

将制备好的载有样品的碳支持膜铜网放入透射电镜样品杆上，样品杆插入镜筒中，调整成像系统合轴，TEM工作电压为200 kV，工作电流为74 μA，点分辨率为0.24 nm，选择合适的放大倍数消除物镜象散后聚焦拍照。

1.5 三维重构实验

1.5.1二维图像的采集首先调节电镜处于TEM模式，平行光束处于低剂量状态，确保Tecnai G2F20场发射电镜处于良好工作状态；在电镜荧光屏下挑选最优取向的目标样品，在Xplore 3D软件中设置合适参数，设置样品杆倾转范围、间隔角，底插CCD相机(Gatan 832)记录一系列不同倾转角度下得到的样品的二维图像。这一过程耗时50 min左右，主要是样品杆按照校准过的倾转轨迹以设定的间隔角度不断倾转，系统不断进行漂移校正和聚焦校正后得到一系列像素为2048×2048的TEM二维图像。影响这一过程的主要因素有：(1)大角度倾转的形状因子，即样品倾转角度越大，样品的二维投影图发生变化，厚度也显著性增加；(2)样品漂移，即样品杆倾转过程中的机械扰动及电子束作用于样品因样品耐受电子束程度不同而导致的不同程度的漂移等；(3)像聚焦和衬度的修正，即每倾转一个角度，系统按照预设的参数自动聚焦、调节欠焦量，获得高衬度、高分辨的二维图像。因此需要设置合理的滤波参数、自动聚焦参数、欠焦量，使系统能够识别样品位置、进行漂移矫正、正确聚焦，从而使CCD相机记录的每张二维图像获得最佳的衬度和分辨率。

1.5.2图像匹配对中及重构如图1，这一过程主要是利用Inspect 3D软件对Xplore软件采集的数据进行后续处理，主要包括(1)压缩数据：将Xplore软件采集的上百张二维图像从像素2 048×2 048压缩到1 024×1 024，从而降低后续三维重构的计算量。如何提高计算机技术使不牺牲每张图像分辨率的情况下完成三维重构的巨大计算量是急需改善的问题。(2)设置滤波参数：设置合理的滤波参数，使每张二维图像形成一个清晰且容易辨识的特征中心点。(3)计算图像偏移量：根据上一步形成的特征中心点，Inspect 3D软件自动计算上百张二维图像之间的偏移量。(4)匹配对中：根据上一步计算的偏移量，Inspect 3D软件自动将上百张二维图像之间的偏差校准。由于采集数据过程中，样品杆机械扰动是样品漂移的最主要因素，因此需要手动调整样品杆在X、Y、Z三个方向上的倾转轴向，从而使上百张图像在各个轴向上的偏移量最小达到匹配对中的目的。(5)选用加权背投影(WBP)、代数迭代(ART)或同步迭代(SIRT)等不同算法进行重构。由于电子断层三维重构技术中的有限倾斜角和高噪声的限制，加权背投影(WBP)往往无法获得高分辨率的重构；代数迭代(ART)每次校正过程只考虑一条射线的投影和该射线所经过的像素点，随机误差较大；同步迭代(SIRT)可选15次及以上的迭代次数，可避免数据缺失和高噪音的影响，因此可获得较好的重构效果[17]。

图1Inspect3D操作流程

Fig.1Inspect3Dworkflow

1.5.3立体模型构建利用Amira软件对重构后的数据进行分析，使三维重构的结果合成为可视化的立体模型并制作录像(movie)。

2 结果与讨论

2.1 一号金纳米颗粒样品的形貌和结构分析

一号纳米金样品经透射电镜和扫描电镜的形貌观察分别见图2(a)和图2(b)，可知纳米金样品两端为针尖状，长度尺寸约600 nm，从SEM图上分散的样品可知：纳米金样品由表面不规则的棱片组装而成，但具体由几个棱片组装而成何种立体结构未可知。由此三维重构实验中采用Tecnai G2F20场发射TEM配置的三维重构软件Xplore采集TEM的原始图片数据，确认选取样品的倾转角度范围为-60°～+70°，对样品进行每隔一度连续倾转采图，一共采集131张原始二维图像。图2(c～e)是样品用三维重构软件Xplore采集TEM的原始数据中分别倾转0°、-60°、+70°的二维图像，可看出即使倾转了不同角度，仅通过二维TEM图像依然无法获知样品的立体结构。应用Inspect 3D 软件对131张二维图像进行匹配对中及重构，并用Amira 软件进行后期立体模型构建，最终三维重构得到的3D模型如图2(f)所示，3D模型的侧切面、横切面及俯视图分别如图2(g)、(h) 、(i)所示，由此可知一号纳米金样品由五个表面为锯齿状的棱片组装而成，棱片表面的锯齿状是不均匀且大小不一的，样品的横切面为五角星状，两端为五角锥状。这些棱片本身、棱片的锯齿状表面、样品的五角锥状两端都分布有曲率较高的边、尖端等，显著地提高样品的表面等离激元特性。

2.2 二号金纳米颗粒样品的形貌和结构分析

二号纳米金样品经TEM和SEM的形貌观察分别见图3(a)和图3(b)，从TEM图片判断纳米金样品为椭圆形，长度尺寸约150 nm，宽度尺寸约50 nm，从SEM图上分散的样品判断：纳米金样品由突起的棱片组装而成，但具体由几个棱片组装而成何种立体结构未可知。由此三维重构实验中采用 Tecnai G2F20 场发射TEM配置的三维重构软件Xplore采集TEM的原始图片数据，确认选取样品的倾转角度范围为-68°～+68°，对样品进行每隔一度连续倾转采图，一共采集137张原始二维图像。图3(c～e)是样品用三维重构软件Xplore采集TEM的原始数据中分别倾转0°、-68°、+68°的二维图像，可看出倾转了不同角度，样品边缘的衬度发生变化，但仅通过二维TEM图像仍无法获知样品的立体结构。应用Inspect 3D软件对137张二维图像进行匹配对中及重构，并用Amira 软件进行后期立体模型构建，最终三维重构得到的3D模型如图3(f)所示，3D模型的侧切面、横切面及俯视图分别如图3(g)、(h) 、(i)所示，由此可知

图2 (a)一号纳米金样品的透射电镜(TEM)图片;(b)纳米金样品的扫描电镜(SEM)图片;纳米金样品在不同倾转角度采集的TEM二维图像:(c)0°,(d)-60°,(e)+70°;(f)重构得到三维立体模型;(g)三维立体模型的侧切面;(h)三维立体模型的横切面;(i)三维立体模型的俯视图Fig.2 (a)TEM image of the first Au sample;(b) SEM image of Au sample;TEM images recorded by TEM tomography of Au nanoparticle at different tilt angles in 1° steps:(c) 0°,(d)-60°,(e)+70°；(f):3D model of the established sample;(g) The lateral aspect of 3D model;(h) The transverse section of 3D model;(i) The top view of 3D model

图3 (a) 二号纳米金样品的透射电镜(TEM)图片;(b) 纳米金样品的扫描电镜(SEM)图片;纳米金样品在不同倾转角度采集的TEM二维图像:(c) 0°,(d)-68°,(e)+68°;(f)重构得到三维立体模型;(g) 三维立体模型的侧切面;(h)三维立体模型的横切面;(i) 三维立体模型的俯视图Fig.3 (a) TEM image of the second Au sample;(b) SEM image of Au sample;TEM images recorded by TEM tomography of Au nanoparticle at different tilt angles in 1° steps:(c) 0°,(d) -68°,(e)+68°；(f):3D model of the established sample;(g) The lateral aspect of 3D model;(h) The transverse section of 3D model;(i) The top view of 3D model

二号金纳米颗粒样品由五个表面不平整的突起棱片组装而成，棱片表面未见曲率较大的尖端，样品的横切面为五角星状，两端为圆包状。这些棱片本身分布有曲率较高的边，有利于提高样品的表面等离激元特性。

3 结论

通过扫描电镜和透射电镜对两种具有表面等离激元特性的金纳米粒子样品形貌观察和分析不能直观准确地确认材料的空间立体结构。本文利用透射电镜三维重构技术，选择合适的采集和重构参数，并进行三维模型的建立，对两种金纳米粒子样品的不同几何形状所产生的边界形态进行了确认和分析。