菲和镉单一及复合污染条件下在毛蚶体内的富集动力学研究

阎波，谭送琴，马晓芳，刘宪斌1,，田胜艳1,，张涛，王璐

1. 天津市海洋资源与化学重点实验室，天津 3004572. 天津科技大学海洋与环境学院，天津 300457

菲和镉单一及复合污染条件下在毛蚶体内的富集动力学研究

阎波1,2,*，谭送琴2，马晓芳2，刘宪斌1,2，田胜艳1,2，张涛2，王璐2

1. 天津市海洋资源与化学重点实验室，天津 3004572. 天津科技大学海洋与环境学院，天津 300457

采用室内半静态双箱动力学模型实验，研究了菲和镉单一及复合污染条件下在毛蚶(Anadara subcrenata)体内的生物富集，通过对富集与释放过程中毛蚶体内菲和Cd的富集量进行非线性曲线拟合，获得了菲和Cd单一及复合污染条件下在毛蚶体内的吸收速率常数k1、释放速率常数k2、生物富集因子BCF、生物半衰期B1/2和平衡状态下最大富集量CAmax等动力学参数。实验结果表明，菲和Cd在实验前期富集速率较高，8 d以后富集速率减缓，释放阶段与富集阶段相似。毛蚶对菲的BCF值为37.80，远大于Cd的BCF值13.12，且生物半衰期时间更长，菲更容易在生物体内富集。菲和Cd联合暴露条件下，在毛蚶体内的CAmax和BCF值均大于单一作用，说明二者同时暴露时，毛蚶对菲和镉的吸收富集均有所增强。实验模型拟合度较好，输出值和实测值之间无显著性差异，拟合方程和拟合参数可信。

菲；镉；毛蚶；单一污染；复合污染；生物富集；动力学

Received27 September 2016accepted22 November 2016

Abstract: The bioconcentrations of phenanthrene and cadmium (Cd) in the tissues of Anadara subcrenata under single and joint exposures were investigated using the semi-static two-compartment kinetic model. The kinetic parameters, including uptake rate constant (k1), elimination rate constant (k2), bioconcentration factor (BCF), biological half-life (B1/2) and maximum bioaccumulation at equilibrium (CAmax), were determined with nonlinear fitting of the time-course phenanthrene and Cd bioconcentration and elimination data. The bioconcentration rates of phenanthrene and Cd were faster during the early stage and slowed down after eight days. The temporal trend of the elimination rate was similar to that of bioconcentration. Phenanthrene possessed a higher BCF (37.80) than did Cd (BCF: 13.12), suggesting that phenanthrene could more easily cause bioconcentration in Anadara subcrenata. In the presence of both phenanthrene and Cd (i.e. joint exposure), CAmaxand BCF increased for both compounds as compared to the condition where only one compound was present (i.e. single exposure). The combination of phenanthrene and Cd thus enhanced their bioconcentrations in Anadara subcrenata. The modeled data are not significantly different from the measured ones, validating the semi-static two-compartment model in studying the kinetics of bioconcentrations of phenanthrene and Cd by Anadara subcrenata.

Keywords: phenanthrene; cadmium; Anadara subcrenata; single exposure; joint exposure; bioconcentration; kinetics

目前，我国近海污染主要表现为富营养化、有机污染和重金属污染为主。其中重金属污染主要包括Cd、Zn、Pb、Hg、Cu等典型污染物[1]。镉作为检出浓度较高，危害系数最大的一类重金属，具有污染范围广，分布面积大以及对生态系统和人类健康造成的危害严重等特点，是其他重金属污染所不及的[2]。多环芳烃则是有机污染的典型代表，在海洋水体和沉积物中可以长期存在[3]。郑关超等[4]研究表明环渤海地区所有养殖水产品中多环芳烃的污染状况特别普遍，其中菲的检出率和平均含量最高，分别为88.5%和6.53 μg·kg-1。目前关于菲和镉在生物体内的富集研究已有很多报道，如陈海刚等[5]研究表明南海海域常见的3种海洋双壳类软体动物菲律宾蛤仔、近江牡蛎和翡翠贻贝对重金属Hg、Pb、Cd都有较高的积累量；李学鹏[6]采用半静态双箱动力学模型在室内条件下模拟了泥蚶和褶牡蛎对Cu、Pb、Cd的生物富集动力学特性。发现当生物富集过程达到平衡状态时生物有机体内重金属含量会随着水体中重金属浓度的增加而增加。吴玲玲等[7]研究发现长江口表层水体中的菲可以对鱼体的腮和肝组织产生毒理效应。刘宪斌等[8]的研究表明底栖动物泥螺对菲的富集规律不仅与其自身的生活、生理习性有关，还受到其栖息环境的严重影响。

在海洋环境中，当多种污染物共同存在于水体中时，便会发生交互作用，产生复合污染和联合毒性[9]。而单一污染机制很难解释多种污染物共存时的联合效应，所以开展多种污染物复合污染条件下对生物体的联合作用的研究很有必要。目前关于复合污染物在生物体内的富集研究仅限于不同重金属的作用研究，菲和镉作为多环芳烃及重金属污染的典型代表，其联合暴露条件下在生物体内的富集动力学研究还很少见。本研究以毛蚶为受试生物，通过室内染毒实验，对菲和镉在单一污染和复合污染条件下在毛蚶体内的富集动力学特征进行了对比研究，以分析菲和镉的联合作用方式。该研究对了解近岸海域经济贝类的污染状况及对人类的潜在危险性评价具有重要的意义，并且可以为海洋污染环境评价和环境监测提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 材料

1.1.1 实验生物

实验所用毛蚶购置于天津市滨海新区海产品市场。实验前先将毛蚶驯养7 d，驯养期间每日换水一次，连续充氧，并定时投喂角毛藻。然后选择新鲜、健康、大小均匀的毛蚶进行实验，体重(9.00±2.00) g，平均壳高(2.0±0.5) cm。实验海水为海水晶配制的人工海水，盐度30‰。

1.1.2 试剂与仪器

菲(phenanthrene)购于美国Sigma公司，纯度>98%。使用N,N-二甲基甲酰胺(DMF，分析纯，天津化学试剂公司)为助溶剂配制菲的母液。重金属镉为CdCl2·2.5H2O，分析纯，天津市化学试剂三厂生产。

分析仪器为美国PE AA800型原子吸收分光光度计，德国Bruker456气相色谱质谱联用仪(GC-MS)。

1.2 实验方法

1.2.1 富集动力学实验

实验分为富集(15 d)和释放(15 d)2个阶段，共设3个实验组和2个对照组，分别是50 μg·L-1菲染毒组(Phe)，500 μg·L-1CdCl2染毒组，50 μg·L-1菲+500 μg·L-1CdCl2复合染毒组，DMF对照组(DMF体积比<0.01%)和人工海水对照组。每组放入70只毛蚶，连续充氧，保证溶解氧含量>5 mg·L-1，水温保持在(23.0±0.5) ℃。

富集阶段：实验共持续15 d，每24 h换水一次。分别在染毒实验的第0、2、5、8、10、12、15天采集3～4只毛蚶，去壳后取其肌肉组织，经匀浆和冷冻干燥处理，研磨成粉末备用。

释放阶段：染毒实验进行15 d后，将容器中的染毒海水全部换成干净的人工海水进行释放实验，实验共持续15 d，每24 h换水一次。分别在染毒实验的第17、20、22、25、27、30天采集3～4只毛蚶，样品处理方法与富集阶段一致。

1.2.2 样品分析

1.2.2.1 毛蚶体内镉含量分析

生物体中镉含量分析采用GB17378.6—2007中8.1无火焰原子吸收分光光度法进行分析测定[10]。

1.2.2.2 毛蚶体内菲含量分析

取冷冻干燥后的样品2 g，加入1 g铜粉、2 g无水硫酸钠及回收率指示物二氢苊-d10(Ace-d10)，用150 mL的二氯甲烷和正己烷混合溶剂(体积比1∶1)索氏提取24 h(70 ℃水浴)，然后用旋转蒸发仪(55 ℃水浴，60～70 rs-1)将提取液蒸发浓缩至5 mL左右，继续氮吹至2 mL，经浓硫酸脱脂后，将样品过硅胶柱(1 cm无水硫酸钠、10 cm硅胶以及1 cm无水硫酸钠，湿法装柱)净化，经正己烷淋洗后，用10 mL的二氯甲烷和正己烷混合溶剂(体积比1∶1)进行洗脱，然后将洗脱液氮吹至少于0.5 mL，加入内标物六甲基苯后，用正己烷定容至0.5 mL，待GC-MS测试。

GC-MS仪器采用VF-5ms(30 m×0.25 mm×0.25 μm)毛细管色谱柱进行分离，质量分析器为离子阱型，离子源为EI源，离子阱温度230 ℃，传输线温度280 ℃，扫描方式SIM。

1.3 数据处理

1.3.1 双箱动力学模型

采用半静态双箱动力学模型[11]对毛蚶体内菲和重金属Cd含量随时间的变化进行非线性拟合，其公式主要描述如下：

富集过程(0

CA=C0+Cwk1/k2(1-e-k2t)

(1)

释放过程(t>t*)：

CA=Cwk1/k2(e-k2(t-t*)-e-k2t)

(2)

式中，t*为富集过程结束的时间(d)；C0表示实验开始前生物体中污染物的含量(μg·g-1)；k1表示生物吸收速率常数；k2表示生物释放速率常数；Cw表示水体污染物浓度(即染毒浓度)(μg·L-1)；CA为生物体内污染物含量(μg·g-1)。

生物富集因子BCF计算公式为：

BCF=k1/k2=limCA/Cw(t→∞)

(3)

生物半衰期公式为：

B1/2=ln2/k2

(4)

富集达到平衡时，生物体内污染物含量CA max的计算公式为：

CA max=BCF×Cw

(5)

1.3.2 数据处理及模型的拟合优度检验

使用Origin 8.0软件分别对菲和镉单一染毒和复合染毒条件下在毛蚶体内富集含量进行非线性曲线拟合，通过决定系数R2来评价双箱动力学模型的拟合优度。同时利用模型计算理论输出值，与实际值进行配对t检验，以此验证双箱动力学模型用于菲和镉单一染毒和复合染毒条件下在毛蚶体内富集研究的可行性，当P<0.05时，差异显著。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 菲测定样品指示物回收率和定量分析

GC-MS测定得到的样品中待测物菲、回收率指示物二氢苊-d10及内标物六甲基苯的特征图谱见图1。可见样品中待测物菲、回收率指示物二氢苊-d10及内标物六甲基苯分离效果较好。样品处理的同时进行空白实验，所有样品指示物二氢苊-d10的回收率均在75%～120%之间，平行样品测定相对标准偏差小于12%，能够满足样品中菲的定量分析要求。采用内标标准曲线法进行定量分析，得到的标准曲线见图2，其相关系数r大于0.99，说明其线性关系良好。

2.2 菲和镉单一染毒和复合染毒条件下在毛蚶体内的富集量

本实验中DMF对照组与人工海水对照组的毛蚶体内菲和重金属Cd本底含量无显著性差异(P>0.05)，因此可以认为选择DMF作为助溶剂，对实验结果没有影响。

图1 样品总离子流图Fig. 1 The total ion chromatogram of sample

图2 菲测定内标标准曲线注：Ci为菲标准系列浓度(μg·L-1)；Cs为内标物六甲基苯浓度(100 μg·L-1)； Ai为菲标准系列测定峰面积；As为内标物六甲基苯测定峰面积。Fig. 2 The internal standard curve for phenanthrene determinationNote:Ci is the concentration of phenanthrene standard series (μg·L-1); Cs is the concentration of hexamethylbenzene, the internal standard substance (100 μg·L-1); Ai is the measured peak area of phenanthrene standard series; As is the measured peak area of hexamethylbenzene.

图3反映的是富集与释放实验阶段，菲和镉单一染毒和复合染毒条件下在毛蚶体内的富集量随时间的变化。由图可见，污染物菲在单一染毒及与镉联合染毒条件下，毛蚶体内的菲含量在富集阶段均随染毒时间的增加而增加，从染毒第8天开始，菲在毛蚶体内的富集速率降低，说明随染毒时间的增加，菲在毛蚶体内的富集量会逐渐趋于平衡。在释放实验阶段，毛蚶体内的菲含量逐渐降低，单一染毒组菲的释放速率明显高于复合染毒组。在整个富集和释放阶段，菲与镉联合染毒条件下，毛蚶体内的菲含量均高于相同浓度的单一染毒组，说明重金属Cd的联合暴露促进了菲在毛蚶体内的富集。

重金属Cd实验组在富集阶段，毛蚶体内Cd在单一和复合染毒条件下的富集量随时间的增加而增加，复合污染条件下的增加速率更为明显。在释放实验阶段，随着释放时间的延长，毛蚶体内Cd含量逐渐降低。在重金属Cd与菲联合染毒条件下，毛蚶体内的镉含量明显高于相同浓度的镉单一染毒组，说明菲的联合暴露促进了重金属Cd在毛蚶体内的富集。

2.3 菲和镉单一染毒和复合染毒条件下在毛蚶体内的富集拟合结果

用半静态双箱动力学模型的公式(1)和(2)分别对毛蚶体内菲和Cd含量随时间的变化进行非线性拟合，得到了菲和Cd单一染毒和复合染毒条件下在毛蚶体内的富集与释放曲线，分别见图4和图5。

图3 菲(Phe)和镉在毛蚶体内生物富集量Fig. 3 Bioconcentration contents of phenanthrene (Phe) and Cd in Anadara subcrenata

图4 菲在毛蚶体内的生物富集曲线Fig. 4 Bioconcentration and elimination curves of phenanthrene in Anadara subcrenata

利用半静态双箱动力学模型分别对毛蚶体内菲和Cd含量随时间的变化进行非线性拟合后，利用公式(1)～(5)计算得到了菲和镉单一染毒和复合染毒条件下在毛蚶体内的富集动力学参数，见表1。

由菲和镉单一染毒与复合染毒条件下在毛蚶体内的富集动力学参数可知，对于污染物菲而言，单一染毒条件下，毛蚶对菲的k1值略高于有Cd存在的复合污染情况，而其k2值则远大于复合污染情况，说明菲进入毛蚶体内吸收和释放的过程中，重金属Cd的存在可以减缓菲从毛蚶体内的释放，延长了菲的生物半衰期，在复合染毒条件下，菲在毛蚶体内的BCF和CAmax值均大于相同浓度条件下菲单一染毒作用。

由重金属Cd在单一染毒和与菲复合染毒条件下在毛蚶体内的富集动力学参数可见，在复合污染条件下，毛蚶对Cd的k1和k2值都大于单一污染情况，k1值表现尤为明显，复合污染条件下毛蚶对Cd的k1值是镉单一污染的1.67倍，说明菲的存在促进了Cd在毛蚶体内的富集，在复合染毒条件下，Cd在毛蚶体内的BCF和CAmax值均大于相同浓度条件下单一染毒作用，表明菲和镉共存对二者在毛蚶体内的富集具有协同效应。

对比毛蚶对菲和镉2种不同污染物的生物富集因子可知，菲的BCF值远大于镉，说明相对于重金属污染物Cd，有机污染物菲更容易在生物体内富集，这与菲的亲脂性有关，与笔者前期对菲和镉单一与联合暴露对毛蚶的氧化胁迫研究结果[12]一致。重金属、多环芳烃等污染物在生物体中的累积通常会对生物体造成氧化胁迫，表现为诱导机体产生活性氧化物(ROS，包括O2·-、H2O2和·OH等)，引发生物膜中脂质过氧化作用，导致丙二醛(MDA)含量升高，超氧化歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、谷胱甘肽(GSH)和酚氧化酶(PO)等抗氧化酶活性的改变，甚至可引起细胞代谢、功能和结构的变化[13-14]。菲对毛蚶SOD和CAT的诱导作用明显大于镉。由于菲的亲脂特性，在毛蚶体内更容易富集，对比毛蚶对菲和Cd的富集动力学参数可见，毛蚶对菲的k1值远大于重金属Cd，而k2值小于Cd，因此菲更容易在生物体内富集，而且不容易释放，生物半衰期时间较长，对生物体表现出的毒性作用更为明显。

图5 镉在毛蚶体内生物富集曲线Fig. 5 Bioconcentration and elimination curves of Cd in Anadara subcrenata

表1 毛蚶对菲(Phe)和镉的富集动力学参数Table 1 Kinetic parameters for bioconcentration of phenanthrene (Phe) and Cd in Anadara subcrenata

注：Cw为染毒浓度；k1为吸收速率常数；k2为释放速率常数；BCF为生物富集因子；B1/2为生物半衰期；CAmax为平衡状态下最大富集量。

Note:Cwis the exposure concentration of pollutants; k1is the uptake rate constant; k2is the elimination rate constant; BCF is the bioconcentration factor; B1/2is the biological half-life; CAmaxis the maximum bioaccumulation contents at the equilibrium state.

菲和镉联合暴露在毛蚶体内的BCF和CAmax值均大于菲和镉的单一作用，这与前期研究得到菲和镉联合暴露对毛蚶的氧化胁迫大于菲和镉的单独作用结论[12]相一致。从表1中的富集动力学参数来看，菲和镉这2种不同的污染物在联合暴露条件下，在毛蚶体内的富集会产生协同效应。对于亲脂性较强的有机污染物菲，重金属Cd的存在可进一步降低其释放速率，延长生物半衰期，增强菲对生物体的毒性作用；而对于重金属Cd而言，菲的存在可促进生物体对镉的富集，增加其在生物体中的最大富集量。其毒理机制还需进一步研究。

在释放实验阶段，当进行清水恢复后，毛蚶体内的菲和重金属Cd含量均有不同程度下降，说明在停止染毒后，毛蚶具有一定的自我恢复能力，随自身的新陈代谢，体内的污染物会逐渐排出。

2.4 模型的拟合优度检验

菲和镉在单一污染和复合污染条件下，在毛蚶体内富集和释放过程的非线性曲线拟合得到的各组决定系数R2值见表2，其数值范围在0.9541～0.9756之间，说明非线性拟合的拟合度较高。同时利用模型计算毛蚶体内菲和重金属Cd的拟合含量，与实际值进行配对t检验，得到的P值均大于0.05，说明2组数据之间不存在显著性差异，拟合方程和拟合参数可信，由此验证本实验条件下半静态双箱动力学模型用于富集研究是可信的。

表2 非线性拟合拟合优度检验信息Table 2 Summary of statistical information to assess the goodness of nonlinear fitting

在实验条件下，菲和镉在毛蚶体内富集阶段前期富集速率较高，8 d以后富集速率减缓，释放阶段与富集阶段相似；毛蚶对菲的生物富集因子BCF值为37.80，远大于重金属Cd的BCF值13.12，且生物半衰期时间更长，说明菲更容易在生物体内富集，这与有机污染物菲的亲脂特性有关；菲和镉在联合暴露条件下，在毛蚶体内的CAmax和BCF值均大于单一作用，说明二者同时暴露时，毛蚶对菲和镉的吸收富集均有所增强，其毒理机制还有待进一步研究；在菲和镉单一污染和复合污染条件下，采用半静态双箱动力学模型对菲和镉在毛蚶体内富集和释放过程进行的非线性曲线拟合，拟合程度较高，模型输出值和实测值之间无显著性差异，说明拟合方程和拟合参数可信。

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◆

KineticsofBioconcentrationsofPhenanthreneandCadmiuminTissuesofAnadarasubcrenataunderSingleandJointExposures

Yan Bo1,2,*, Tan Songqin2, Ma Xiaofang2, Liu Xianbin1,2, Tian Shengyan1,2, Zhang Tao2, Wang Lu2

1. Tianjin Key Laboratory of Marine Resource and Chemistry, Tianjin 300457, China2. College of Marine and Environmental Sciences, Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457, China

10.7524/AJE.1673-5897.20160927001

2016-09-27录用日期2016-11-22

1673-5897(2017)3-572-07

X171.5

A

阎波(1973—)，女，环境科学工学博士，副教授，主要研究方向为污染物迁移转化及其环境效应。

天津市应用基础与前沿技术研究计划(15JCYBJC23200)资助项目

阎波(1973—)，女，环境科学工学博士，副教授，研究方向为污染物迁移转化及其环境效应，E-mail: yanbo@tust.edu.cn

阎波, 谭送琴, 马晓芳, 等. 菲和镉单一及复合污染条件下在毛蚶体内的富集动力学研究[J]. 生态毒理学报，2017, 12(3): 572-578

Yan B, Tan S Q, Ma X F, et al. Kinetics of bioconcentrations of phenanthrene and cadmium in tissues of Anadara subcrenata under single and joint exposures [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 572-578 (in Chinese)