雷帕霉素对肺癌LK2细胞microRNA表达的影响

杜美琳 申明惠 彭扬 姜洪芳 王超 何平

雷帕霉素对肺癌LK2细胞microRNA表达的影响

杜美琳 申明惠 彭扬 姜洪芳 王超 何平

目的研究药物雷帕霉素作用于非小细胞肺癌LK2细胞后microRNA表达的变化。方法培养肺癌LK2细胞，研究药物雷帕霉素作用于非小细胞肺癌LK2细胞后microRNA表达的变化。方法培养肺癌LK2细胞，检测雷帕霉素作用于LK2细胞后其中microRNA的表达变化，并对表达有显著差异改变的microRNA进行靶基因预测。结果与对照组相比，雷帕霉素作用于LK2细胞后，9个microRNAs表达具有高显著差异，其中miR-320c，miR-1283，miR-29b-3p等6个miRNAs表达显著增强。而miR-320b，miR-19b-3p，miR-181c-6p表达明显降低。结论雷帕霉素作用于肺癌LK2细胞后，可诱导多个microRNA的表达改变，可以加强部分microRNAs表达、也可降低多个microRNAs的表达。

雷帕霉素；肺癌；microRNA

现今，随着人口老龄化，癌症的发病率亦升高，其中肺癌是我国常见的恶性肿瘤之一[1]。雷帕霉素（Rapamycin，Rapa）最先是作为一种免疫抑制剂被广泛应用，近年来发现其可以对包括肺癌的多种肿瘤细胞起抑制作用[2-3]。微小RNA（microRNA，miRNA）为内源性非编码小分子单链RNA，可作为癌基因或抑癌基因控制肿瘤发生、发展。目前，对于帕霉素作用机制与非编码miRNA的相关研究报道较少，而研究发现，一些药物能够改变肿瘤细胞中部分miRNA的表达[4]，提示这些药物可能是通过调控miRNA的表达发挥抑制肿瘤作用。为抗肿瘤机理研究提供了新的研究方向。本实验拟通过Illumina HiSeqTM 2500 miRNA测序，对比雷帕霉素作用于肺癌LK2细胞后miRNA的表达变化，并预测miRNA靶基因，筛选其中的增殖凋亡相关基因。在miRNA水平研究雷帕霉素对LK2细胞的可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

RPMI-1640培养基购自Gibeo公司。胎牛血清购自天津索莱宝生物工程有限公司。0.25%胰蛋白酶购自以色列Biological Industries公司。Trizol购自大连宝生物工程公司。雷帕霉素购自上海纯优生物科技有限公司。离心机型：Eppendorf型，德国。二氧化碳培养箱：HERA cell 150型，德国。细胞系：人肺癌LK2细胞由中国医科大学细胞生物教研室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 首先在10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，在饱和湿度、5%二氧化碳、37℃的培养箱中培养人肺癌LK2细胞。取对数生长期的LK2细胞，接种于75 cm2的培养瓶中过夜，加入浓度为1 μmol/L的雷帕霉素，并采用等量培养基作为阴性对照，继续于37℃、5%二氧化碳的饱和湿度温箱中培养48 h。

1.2.2 检测筛选miRNA PBS洗2遍，每个培养瓶加入1 ml Trizol，使其充分接触细胞，待细胞悬浮，用去RNA酶处理的枪头吹打混匀，吸入经去RNA酶处理过的EP管中，提取的总RNA于-80℃保存。提取的总RNA（空白对照及实验组）于干冰中邮寄到广州锐博公司，通过Illumina HiSeqTM 2500测序雷帕霉素作用后肺癌LK2细胞中miRNA的表达变化。测序过程：（1）制备cDNA文库进行测序。（2）测序所得到序列（Reads）集，去掉序列两端接头、去掉低质量序列进行最初的数据初步过滤，进而得到干净序列，对其进行序列的长度统计以及样本间公共序列统计。对miRNA的差异表达筛选。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13.0软件对数据进行分析处理，计量资料以（均数±标准差）表示，采用t检验；以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

测序筛选雷帕霉素作用LK2细胞后miRNA的表达变化。9个miRNA表达显著差异，miR-320c，miR-1283，miR-29b-3p，miR-181c-5p，miR-24-3p，miR-26a-5p表达显著增强。miR-320b，miR-19b-3p，miR-181c-6p表达显著降低。同时还有6个表现出差异的miRNA（表1）。

3 讨论

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一种真核生物内源性非编码的小分子单链RNA。miRNA长度约18～25个核苷酸。miRNAs通过形成RNA诱导沉默复合体与靶基因3’端的非翻译区非完全互补配对相结合，诱导mRNA降解，抑制靶向基因的表达[5]，进而参与细胞的增殖、凋亡[6]。目前已发现多种miRNAs在肺癌组织或肺癌细胞系中表达异常[7]。虽然目前对miRNA的研究尚不明确，但已有实验可证明miRNA表达与人类肺癌有相关性，且具较高的特异性，比如miR-155、miR-145、miR-34、miR-202等在肺癌细胞中较正常细胞表达异常[7-9]，提示miRNA可能是抗癌药物潜在的作用靶点。雷帕霉素是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammal target of rapamycin，mTOR）的抑制剂，通过与mTOR结合可影响多种肿瘤细胞的体外增殖和生长周期[10-11]，mTOR信号通路的异常激活，可以调控相关蛋白的表达，且有证据显示mTOR抑制剂的抗肿瘤作用可以产生延长稳定期或缓解病情的作用[12]。这些将推动雷帕霉素的进一步研究。虽然已有研究表明雷帕霉素具有抑制肺癌肿瘤细胞的作用，且其抗癌的复杂作用机制仍然是目前的研究热点，但现研究多为联合药物观察临床疗效或侧重于观察调控编码蛋白基因表达，而对非编码miRNA分子与雷帕霉素治疗研究的报道研究较少。miRNA通过影响RNA对基因表达翻译起作用，在调控肿瘤生长中起到枢纽作用，因此miRNA在肿瘤治疗中可能成为药物的作用靶点，提示作用靶点既包括编码蛋白的相关基因，还可包括非编码区的miRNA，为开发抗肿瘤药物提供了新的方向。

表1 LK2细胞应用雷帕霉素的miRNA 表达成倍比例改变

本实验通过筛选雷帕霉素作用于LK2细胞后miRNA的表达变化，观察到9个miRNA表达显著差异，其中miR-320c、miR-1283、miR-29b-3p、miR-181c-5p、miR-24-3p、miR-26a-5p表达显著增强。miR-320b、miR-19b-3p、miR-181c-6p表达显著降低。通过预测有显著差异的miRNA相关靶基因，为雷帕霉素对LK2细胞的增殖及凋亡的影响研究提供了依据。实验结果表明，雷帕霉素作用LK2细胞后可调控诱导多个miRNAs表达改变。本实验初步筛选了miRNA在雷帕霉素作用于肺磷癌系LK2细胞后miRNA的改变，为治疗肿瘤的机理研究提供了新的研究思路和理论依据。

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The Effect of Rapamycin on microRNA Expression of Lung Cancer LK2 Cell

DU Meilin SHEN Minghui PENG Yang JIANG Hongfang WANG Chao HE Ping Department of Geriatrics, Shengjing Hospital Affiliated to China Medical University, Shenyang Liaoning 110004, China

ObjectiveTo study the effects of rapamycin on microRNA expression of lung cancer LK2 cell in vitro culture.MethodsIt was objective to culture lung cancer LK2 cells and to study the changes of microRNA expression after rapamycin treatment in non-small cell lung cancer LK2 cells, target genes were predicted for microRNA with significant differences in expression.ResultsThe treatment of cells with rapamycin could affect the expression of microRNAs. Using Illumina HiSeqTM 2500 miRNA Sequencing analysis, 9 microRNAs were found with high expression changes in rapamycin -treated LK2 cells. In these miRNAs, miR-320c, miR-1283, miR-29b-3p express higher. miR-320b,miR-19b-3p, miR-181c-6p express lower.ConclusionAfter rapamycin act in lung cancer LK2 cells, it can induce multiple microRNA expression changes, such as enhance and reduce the expression of some microRNAs.

rapamycin; lung cancer; microRNA

R734

A

作者单位：中国医科大学附属盛京医院老年病科，辽宁 沈阳 110004

1674-9308（2017）21-0150-03

辽宁省科学计划项目（2013225021）

基金项目：盛京自由研究者计划（201205）

何平

10．3969/j．issn．1674-9308．2017．21．079