超高效液相色谱-质谱测定牛乳中游离氨基酸

赵瑞，崔进，梅连瑞，许晓菁，金钥，闫师杰，3，*，刘祥

（1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津300384；2.天津市产品质量监督检测技术研究院，天津300308；3.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津300384；4.天津市食品安全检测技术研究院，天津300308）

超高效液相色谱-质谱测定牛乳中游离氨基酸

赵瑞1，崔进2，梅连瑞2，许晓菁2，金钥2，闫师杰1，3，*，刘祥4，*

（1.天津农学院食品科学与生物工程学院，天津300384；2.天津市产品质量监督检测技术研究院，天津300308；3.天津市农副产品深加工技术工程中心，天津300384；4.天津市食品安全检测技术研究院，天津300308）

建立牛乳中未衍生游离氨基酸的超高效液相色谱串联质谱的测定方法。样品采用酸化乙腈沉淀蛋白，正己烷脱脂，氮吹至近干后初始流动相复溶，超声溶解离心过膜后检测。结果显示：在14 min内所分析目标物得到较好的分离，浓度与峰面积的线性关系良好，相关系数在0.991 2～0.999 8之间，回收率在76%～124%，相对标准偏差1.0%～12.9%。

牛乳；未衍生游离氨基酸；超高效液相色谱串联质谱；亲水作用

Abstract：A method for determining of underivatized free amino acids in milk was developed with ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）.The protein of sample was precipitated with acid acetonitrile，the supematant was purified by n-hexane，then the purified solution was concentrated by nitrogen，dissolved with the initial mobile phase by ultrasonic assistance，centrifuged and filtered for ultra-high performance liquid chromatographic analysis.The results indicated that good separation of amino acids was obtained within 14 min.The linearity of the investigated compounds between concentrations and their peak areas within the test ranges was good，and the correlation coefficient was from 0.991 2 to 0.999 8.The average recoveries and relative standard deviations of 14 amino acids at three spiked levels were in the range of 76%-124%and 1.0%-12.9%respectively.

Key words：milk；underivatized free amino acids；ultra-high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）；hydrophilic interaction

鲜牛乳中含有一定量人体所必需的游离氨基酸，它可以提高人体免疫功能从而起到预防作用，谷氨酸和甘氨酸是其主要形式，其含量是一定的。但是近年来部分商家受利益的驱使，会在牛奶中添加非蛋白含氮化合物或者是单一的氨基酸[1]，以期提高牛奶中蛋白含氮量。因此，为解决牛乳中额外添加氨基酸的问题，对牛乳中游离氨基酸的定量检测非常必要。

大多数氨基酸本身不具有紫外吸收和荧光检测的发色基团，所以当使用氨基酸分析仪[2]传统的液相色谱法[3-5]、薄层色谱法[6]及毛细管电泳法[7]等，首先需要对氨基酸进行衍生处理，其方法操作繁琐、衍生试剂不稳定、有副产物干扰及延长分析时间，给氨基酸的测定带来了诸多的不便。随着质谱的发展，有些学者研究了不需衍生的高效液相-蒸发光散射检测[8]（High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light scattering Detector，HPLC-ELSD）及高效液相色谱质谱联用[9]（High Performance Liquid Chromatography Mass Spectrometry，HPLC-MS）等，但是这些方法往往在流动相中添加了三氟乙酸、全氟酸七氟丁酸、等离子对试剂，这些试剂容易对色谱柱及仪器造成污染。鉴于此，本试验应用亲水作用色谱模式下的超高效液质质谱技术测定氨基酸，实现了不衍生、高分辨率、高灵敏、高速分析牛奶中的游离氨基酸。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

AB Triple Quad 6500型串联四级杆质谱联用仪：美国AB公司，配Agilent 1290型超高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；ML204/02型天平：Mettler-Toledo公司；PICOZ1型低温高速离心机：美国Thermo公司；OA-SYS型氮吹浓缩仪：美国Organomation公司；IKA MS3 DIGITAL涡旋仪：上海研域仪器设备有限公司；Waters Symmetry 色谱柱（C18 4.6×150 mm，5 μm）：美国 Waters公司；Kinetex HILIC 100A HPLC Column（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）：美国菲罗门Phenomenex公司；ZIC-HILIC 柱（100 mm×2.1 mm，3.5 μm，100A）：德国Merck公司。

超纯水（屈臣氏蒸馏水）：广州屈臣氏食品饮料有限公司北京饮料分公司；乙腈（色谱纯）：德国MERCK公司；甲酸（ACS纯）、甲酸铵：美国Sigma公司。

氨基酸混标：丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、亮氨酸（Leu）、异亮氨酸（Ile）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、甲硫氨酸（Met）、丝氨酸（Ser）、苯丙氨酸（Phe）、苏氨酸（Thr）、缬氨酸（Val）、酪氨酸（Tyr）、谷氨酸（Glu）、赖氨酸（Lys）、甘氨酸（Gly），浓度均为 2.5 μmol/mL，溶剂为0.1 mol/L盐酸：美国Sigma-Aldrich公司。

标准溶液的配制：取0.1 mL氨基酸混标于10 mL棕色容量瓶中，以0.1 mol/L盐酸溶解和定容，得到25 μmol/L的标准储备液；再配制成2.5 μmol/L的混合标准中间液；用时根据需要，用初始流动相将中间液进行稀释，稀释成适当浓度作为标准工作液。

1.2 色谱条件

色谱柱：Kinetex HILIC 100A色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）。

条件：流动相：A相为10 mmol/L甲酸铵-水，B相为2 mmol/L甲酸铵-3%水-乙腈（均含有0.15%甲酸）；流速0.3 mL/min；进样量2 μL；柱温35℃。梯度洗脱见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 The program of gradient elution

1.3 质谱条件

三重四极杆串联质谱多反应监测（MRM）；电喷雾正离子（ESI+）模式扫描；电喷雾电压（IS）：5 500 V；离子源温度：550℃；雾化气压力（GS1）：60 psi；辅助气压力（GS2）：60 psi；气帘气压力（CUR）：30 psi。经优化后的各类化合物的质谱参数如表2。

表2 氨基酸的主要质谱采集参数Table 2 Mass spectrometric and acquisition parameters of amino acids

1.4 样品前处理

称取1.0 g样品（精确至0.000 1 g）于15 mL离心管中，用2%甲酸乙腈定容到10 mL，涡旋振荡1 min，超声提取10 min，4℃下9 500 r/min离心10 min。全部转移上清液于离心管中，加5 mL正己烷，涡旋2 min，静置分层后弃上层液体。下层溶液于30℃水浴氮吹至近干。添加初始流动相复溶，超声1 min后9 500 r/min离心5 min，上清液经0.22 μm有机微孔滤膜过滤后上机测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱与色谱条件的优化

2.1.1 质谱条件的优化

氨基酸为极性化合物，故试验选择ESI离子源[10]。将浓度为0.25 μmol/L氨基酸标准溶液采用直接针泵进样方式注入质谱仪中，在正离子模式下进行母离子质谱扫描，得到各个氨基酸丰度较高的[M+H]+准分子离子峰。以母离子为基础进行二级质谱分析选择出两个子离子，最后对各自的碰撞能量、去簇电压等参数进行优化，使其离子丰度和方法的灵敏度达到最佳。正离子模式下测定的氨基酸质谱参数见表2。

2.1.2 色谱条件的优化

2.1.2.1 色谱柱的选择

氨基酸是一类极性较大的小分子量化合物，在传统的C18柱上几乎无保留。本试验尝试选择Waters Symmetry C18（5 μm，4.6×150 mm）进行分离检测，发现部分生物胺的峰形较好且响应也较高，但是均集中在1min出峰，随后调节流动相组成和改变梯度洗脱，保留时间也没有出现明显改善。W A Huub Waterval[11]和汤新星[12]均使用C18在流动相中添加全氟庚酸实现了氨基酸的未衍生检测。但全氟庚酸属于离子对试剂，虽然可以改善极性化合物在反相色谱柱中的分离效果，但这些试剂不易挥发且对检测的离子抑制效应非常明显，不适用液质联用。

亲水作用色谱（HILIC）于1990年由Andrew Alpert提出，是一种针对强极性化合物的新型液相色谱技术，其保留机制较为复杂，包括氢键作用、静电作用和偶极作用等，常使用硅胶、氰基、氨基等填料[13]。根据氨基酸的特点，同时氨基酸中既有碱性氨基酸、中性氨基酸，又有酸性氨基酸，试验首先选择固定相为两性离子甜菜碱的Merck ZIC-Hilic色谱柱对化合物进行测试。结果发现，氨基酸有较好的保留和分离效果，且峰形较好。但在进一步的加标试验和实际样品检测过程中，发现该色谱柱的耐受性较差，随着试验样品量的增加，色谱峰拖尾现象明显，结果重复性下降。随后尝试采用耐用性相对较好的[14]Kinetex HILIC（2.6 μm，100×2.1 mm）色谱柱，试验结果表明该色谱柱可以在小比例水相流动相的情况下很好地将目标物保留和分离。

2.1.2.2 流动相的选择

采用流动相中均添加甲酸铵，不仅可以使待测物质容易质子化而提供足够的带电离子，而且整个分离系统维持在一个相对稳定的酸性环境中，有利于增加目标物色谱峰形尖锐，提高灵敏度。为提高氨基酸的分离度，同时减少样品的基质效应，结合色谱柱的分离特性，选择在流动相中添加甲酸。试验还考察了流动相中甲酸铵的浓度和pH值、梯度洗脱的设置等条件对分离效果的影响，最终确定了最佳的流动相条件，使得HILIC柱显示出较好的分离效果，并且具有较好的重现性和稳定性，其色谱图如图1。

图1 氨基酸混合标准溶液的典型MRM色谱图Fig.1 Representative MRM chromatograms of amino acids mixed standard

2.2 样品前处理方法的优化

牛奶中含有大量的蛋白质，若不除去将严重干扰目标物的测定，参考文献报道其方法主要[15]分为两种思路：蛋白质沉淀法和固相萃取法。固相萃取法的净化效率较高，但是对目标物氨基酸损失较大，并且氨基酸有是一大类包含至少一个羧基、一个氨基官能团的极性化合物，很难靠单纯的阴阳离子固相萃取法同步实现十多种物质的净化，不适用于大量样品的检测。沉淀蛋白的方法主要有沉淀剂沉淀、酸沉淀、有机溶剂沉淀等。氨基酸在纯有机溶剂中的溶解度较水溶性溶液中的溶解度小，液态奶中本身为水溶液，同时考虑到ESI+检测模式，本试验采取酸化乙腈方式进行沉淀蛋白。参考文献[16]使用三氯乙酸，但发现三氯乙酸的沉淀效果较差，离心后上层液仍较为浑浊，试验选择甲酸。为兼顾回收率和降低基质效应两个方面，试验比较了0.5%、1%、2%的甲酸比例，结果表明当使用0.5%甲酸时，只有部分氨基酸有信号响应。甲酸比例为1%、2%时所有氨基酸均有信号响应，但2%甲酸处理后的信号强度较强，同时很大程度地降低了基质效应，故选择2%甲酸。因牛奶中油脂含量也相对较多，导致氮吹干加流动相复溶后溶液浑浊，预先用正己烷萃取去除脂质可有效消除这种现象。

2.3 方法学验证

将15种氨基酸混合标准中间液稀释成0.08、0.25、0.5、0.8、1.0、1.5 μmol/L 6 个不同浓度，按照优化的方法测定后以氨基酸峰面积（y）对其浓度（x）进行线性回归分析，得到15种氨基酸的标准曲线，结果见表3。

表3 氨基酸回归方程、线性系数、定量下限、回收率及相对标准偏差Table 3 Limits of regression equations，correlation coefficients，quantitation（LOQs），recoveries and RSDs of amino acids（n=6）

如表3所示，15种氨基酸在浓度为0.08 μmol/L～1.5μmol/L范围内线性关系良好，在0.9912～0.9998之间；分别向样品中添加低中高3个水平（2、10、20 μmol/L）的氨基酸，重复6次，计算回收率和重复性；以色谱峰面积10倍信噪比（S/N）计算氨基酸的定量下限。

2.4 方法应用

按照本试验中所优化的方法，对新鲜牛奶、巴士杀菌奶和超高温奶中的游离氨基酸进行了检测，方法重现性、回收率较好。

3 结论

建立牛乳中游离氨基酸的超高效液相串联质谱测定方法。样品前处理使用蛋白质沉淀法，亲水液相色谱质谱检测，无需对氨基酸进行衍生处理。该方法的目标氨基酸的相关系数大于0.99，定量下限范围为0.008 μmol/L～0.08 μmol/L，平均回收率为 76%～124%，相对标准偏差1.0%～12.9%。本方法前处理技术简单、试验成本低、分析效率高，检出限能够满足牛乳中游离氨基酸的要求，是快速、全面、准确测定牛乳中游离氨基酸的可靠方法，为判定牛乳及其制品的质量及营养价值提供了科学依据。

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Determination of Free Amino Acids in Milk by Ultra-Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Rui1，CUI Jin2，MEI Lian-rui2，XU Xiao-jing2，JIN Yue2，YAN Shi-jie1，3，*，LIU Xiang4，*
（1.College of Food Science and Biological Engineering，Tianjin Agricultural University，Tianjin 300384，China；2.Tianjin Product Quality Supervision and Testing Technology Research Institute，Tianjin 300308，China；3.Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing，Tianjin 300384，China；4.Tianjin Food Safety Testing Technology Research Institute，Tianjin 300308，China）

2017-02-06

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.034

赵瑞（1989—），女（汉），硕士研究生，主要从事动物源性食品安全与营养。

*通信作者：闫师杰（1971—），男（汉），教授，博士，主要从事食品质量与安全、食品贮藏与保鲜；刘祥（1976—），男（汉），正高级工程师，博士，主要从事食品安全检测与分析。