广陈皮提取物的HPLC指纹图谱研究

张利，黄敏，王婷，余楚纯，李立群，叶金玉，刘梅森

（深圳市味奇生物科技有限公司，广东深圳518109）

广陈皮提取物的HPLC指纹图谱研究

张利，黄敏，王婷，余楚纯，李立群，叶金玉，刘梅森*

（深圳市味奇生物科技有限公司，广东深圳518109）

建立广陈皮提取物的高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）指纹图谱，为陈皮提取物原料的质量控制提供依据。采用HPLC法分析测定13批广陈皮样品。色谱柱：EclipseXDB-C18（4.6mm×150mm，5μm）；流动相：甲醇-2.0%乙酸水溶液梯度洗脱；检测波长：283 nm；柱温：25℃；流速：1.0 mL/min；上样量：10 μL。建立广陈皮提取物的指纹图谱，确定出11个共有峰，广陈皮样品的相似度在0.967～0.974之间。

广陈皮；橙皮苷；高效液相色谱；指纹图谱

Abstract：To establish a method of fingerprint analysis on Citri reticulatae pericarpium extract by high performance liquid chromatography（HPLC），and provide the basis for the quality control of Citri reticulatae pericarpium extract raw materials.Using HPLC analysis method to determine the 13 batches of samples Citri reticulatae pericarpium.HPLC with Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）chromatographic column was used.The mobile phase was methanol-2.0%acetic acid at gradient elution；the detection wavelength was at 283 nm with column temperature at 25℃；flow rate was at 1.0 mL/min；sample quantity was 10 μL.The establishment of a citri reticulatae pericarpium extract fingerprint，determine the 11 common peaks，the similarity of Citri reticulatae pericarpium samples was between 0.967 to 0.974.

Key words：Citri reticulataepericarpium；hesperidin；high performance liquid chromatography（HPLC）；fingerprint

陈皮为芸香科植物橘Citrus reticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮，陈皮药材分为“陈皮”和“广陈皮”[1]。陈皮主要含挥发油及以橙皮苷为主的黄酮类成分等，一般通过测定橙皮苷的含量作为评价陈皮的质量指标。《中国药典》中以单一指标成分——橙皮苷来衡量陈皮的质量，但其它地区陈皮中橙皮苷的含量往往比广陈皮高，表明这一单一指标无法说明广陈皮的特色。研究显示，建立广陈皮指纹图谱可综合评价广陈皮原料的质量[2-5]。由于我公司植物固体饮料产品对陈皮提取物的需求量大，陈皮原料的质量必将影响最终产品的品质。因此本研究对广东省江门市新会地区不同来源、不同贮藏年限的广陈皮进行高效液相色谱研究，建立广陈皮甲醇提取物的特征指纹图谱，为广陈皮提取物原料的质量控制提供重要依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

MJ-176NR榨汁搅拌机：松下电器产业株式会社；ME204E电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HS6150超声清洗机：北京康林科技有限公司；GM-0.33A隔膜真空泵：天津市津腾实验设备有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪：安捷伦科技（中国）有限公司。

1.2 试药

橙皮苷标准品（批号：110712）：广州药检所；13批广陈皮药材：广东省江门市新会区新宝堂陈皮有限公司，具体品种及贮藏年限见表1；甲醇为色谱纯；冰乙酸为优级纯。

表1 广陈皮样品品种及贮藏年限Table 1 Varieties and storage life ofCitri reticulataepericarpium sample

2 方法与结果

2.1 样液的制备

取广陈皮原料置于60℃恒温干燥箱中干燥4 h，粉碎，过80目筛。准确称取广陈皮粉末0.5 g置于50 mL具塞比色管中，精密加入甲醇25 mL，称重，超声提取45 min，用甲醇补足损失的重量，过滤，取滤液再用0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取橙皮苷标准品，加甲醇配制成浓度为0.2 mg/mL的橙皮苷标准溶液。

2.3 色谱条件

色谱柱：EclipseXDB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇（A）-2.0%乙酸水溶液（B），梯度洗脱条件：0～20 min（20%A～40%A），20 min～35 min（40%A～70%A），35 min～55 min（70%A～100%A），55 min～60 min（100%A），60 min～65 min（100%A～20%A）；检测波长：283 nm；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL/min；上样量：10 μL。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度试验

取同一批次的广陈皮甲醇提取液，连续进行5次HPLC检测得到相应的色谱图，通过中药指纹图谱相似度评价系统进行分析。结果表明，5个图谱主要色谱峰保留时间的相对标准偏差（RSD）在0.13%～0.30%之间，峰面积的RSD值在3.0%以内，5次连续进样所得液相色谱图中主要峰的保留时间与峰面积的精密度较高，证明仪器的精密度良好。

2.4.2 重复性试验

取同一批次的广陈皮原料各5份，按照“2.1”方法制备甲醇提取液后进行HPLC检测得到相应的色谱图，通过中药指纹图谱相似度评价系统进行分析。结果表明，5个图谱主要色谱峰保留时间的RSD值在0.12%～0.28%之间，峰面积的RSD值在3.0%以内，试验所得液相色谱图中主要峰的保留时间与峰面积的精密度较高，证明本方法测定的重复性良好。

2.4.3 稳定性试验

取同一批次的广陈皮甲醇提取液，分别于制备后0、4、8、12、24 h 进行 HPLC 检测得到相应的色谱图，通过中药指纹图谱相似度评价系统进行分析。结果表明，5个图谱主要色谱峰保留时间的RSD值在0.10%～0.30%之间，峰面积的RSD值在3.0%以内，试验所得液相色谱图中主要峰的保留时间与峰面积的精密度较高，证明在24 h内样品溶液的稳定性良好。

2.5 指纹图谱的建立及评价

2.5.1 不同品种、不同贮藏年限广陈皮指纹图谱的建立

取对照品溶液和制备的广陈皮提取物样液，按上述色谱条件进行分析测定，得到各批样品的色谱图。将色谱图积分处理后以AIA格式导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件进行数据处理，经过设参照谱、自动匹配、生成对照图谱等步骤，采用中位数法得到S1～S13指纹图谱。13批广陈皮样品的指纹图谱见图1，图中R为系统生成的对照图谱。

13批广陈皮样品的共有峰有12个，但第1个峰的保留时间为1.454 min，此峰为溶剂峰，因此13批样品共计标出11个共有峰，以1、8、11号峰为三强峰，具有明显的指纹图谱特征性。由对照品溶液的色谱图对比可知，保留时间为20.592 min的1号色谱峰为橙皮苷峰，且峰面积最大，以此为参照峰，计算其余共有峰的相对保留时间及相对峰面积，具体数据见表2和表3，13批陈皮样品共有峰的指纹图谱匹配结果见表4。

由共有峰的指纹图谱匹配结果可知，11个共有峰相对保留时间的RSD＜0.30%，表明13批广陈皮样品提取物共有峰的出峰时间基本一致。但由于陈皮品种的不同，各样品在色谱峰数量上存在一定的差异，第2至5批陈皮品种为青皮和微红皮，其色谱峰数量明显少于大红皮品种。13批广陈皮样品的共有峰在峰面积的精密度上普遍存在较大差异，这表明由于陈皮原料的品种、产地以及贮藏年限的不同，陈皮提取物中相同化学成分的含量有着较大差异性。

图1 广陈皮指纹图谱Fig.1 Fingerprint ofCitri reticulataepericarpium

表2 13批广陈皮样品共有峰的相对保留时间Table 2 13 batches ofCitri reticulataepericarpium relative retention time of common peak

表3 13批广陈皮样品共有峰的相对峰面积Table 3 13 batches ofCitri reticulataepericarpium samples common peak relative peak area

表4 13批广陈皮样品共有峰的指纹图谱匹配结果Table 4 13 batches ofCitri reticulataepericarpium samples common peak of fingerprint matching results

2.5.2 指纹图谱相似度评价

由“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”软件对色谱图进行自动匹配后，进行图谱的相似度计算，结果见表5。

表5 13批广陈皮样品指纹图谱相似度分析结果Table 5 13 batches ofCitri reticulataepericarpium samples of fingerprint similarity analysis results

13批广陈皮样品指纹图谱的相似度较高，相似度在0.967～0.974之间，表明利用指纹图谱相似度可以较好地评价陈皮原料的质量。

3 讨论

广陈皮所含成分较复杂，各成分的极性差别也较大，若采用等度洗脱，改变流动相的组成或比例只能得到较少的色谱峰，且洗脱时间长，色谱峰分离度差。而采用梯度洗脱，广陈皮样品中不同极性组分均获得了适度保留，能较全面地反映样品信息[6]。试验考察了甲醇-2%乙酸水溶液、甲醇-6%冰乙酸水溶液、乙腈-1%乙酸水溶液等流动相体系，以甲醇-2%乙酸水溶液系统洗脱得到的色谱峰数量最多，且分离较好，故选用该系统。

用不同的检测波长检测（283 nm和330 nm）及二极管阵列检测器分析，橙皮苷峰在283 nm波长下有最大吸收，283 nm波长下的色谱峰多于330 nm，且色谱峰响应值大，基线较平稳，因此选择283 nm作为广陈皮指纹图谱的检测波长。

采用高效液相色谱法对各批广陈皮样品进行了研究，各批次样品的色谱图虽然存在一定的差异，但均具有相同的色谱特征峰。该方法每批次均能获得众多的色谱峰，分离效率高，且对于不同来源的广陈皮样品，各色谱峰的保留时间相对稳定，所建立的指纹图谱稳定、可靠。

分析比较了不同品种、不同贮藏年限的13批广陈皮样品的色谱图，共标出11个共有峰，各共有峰的保留时间匹配较好，保留时间的RSD＜0.30%。但因品种及贮藏年限的差异，各样品在色谱峰总量上存在一定的差异，此外共有峰在峰面积的精密度上普遍存在较大差异，表明广陈皮中相同化学成分的含量有着较大差异性。13批广陈皮样品指纹图谱的相似度在0.967～0.974之间，可利用该指纹图谱来评价陈皮原料的质量，从而建立广陈皮提取物的质量控制标准，保证最终产品质量。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版一部[M].北京:中国医药科技出版社,2015:191

[2]杨洋,蒋林,郑国栋,等.道地药材广陈皮的HPLC指纹图谱研究[J].中药材,2011,34(2):191-195

[3]黄月纯,魏刚.广陈皮HPLC指纹图谱的建立及在药材鉴定中的应用研究[J].中草药,2008,39(2):275-277

[4]陈永刚,林励.柑橘属常用中药黄酮类成分HPLC指纹图谱研究与比较[J].中国中药杂志,2011,36(19):2660-2665

[5]胡灵.玉环柚柚皮中黄酮类化合物提取、分离及指纹图谱的研究[D].杭州:浙江工业大学,2011:39-50

[6]封宇飞,张宏武,邹忠梅,等.陈皮饮片高效液相指纹图谱研究[J].中国药业,2012,21(24):28-31

HPLC Fingerprint of Citri reticulatae Pericarpium Extract

ZHANG Li，HUANG Min，WANG Ting，YU Chu-chun，LI Li-qun，YE Jin-yu，LIU Mei-sen*
（Shenzhen Weicky Biotechnology Co.，Ltd.，Shenzhen 518109，Guangdong，China）

2016-12-28

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.027

深圳市战略新兴产业发展专项资金（CXZZ201406251 61734122）

张利（1983—），女(汉），硕士研究生，研究方向：食品、保健食品的研究与开发。

*通信作者：刘梅森（1968—），男（汉），教授级高级工程师，博士，研究方向：天然植物提取物的研究开发。