应用41Ca-AMS技术开展肥城桃钙示踪研究

杨宪林，赵庆章，李 玲，王 雷，庞义俊，王小明，窦 亮，张 慧,4，杨旭冉，武绍勇，高东升，孙科鹏，周 君，何 明，董克君，沈洪涛，姜 山

(1.中国原子能科学研究院，北京 102413；2.广西师范大学，广西 桂林 541004；3.山东农业大学，山东 泰安 271018；4. 黑龙江省科学院技术物理研究所，黑龙江 哈尔滨 150086)

应用41Ca-AMS技术开展肥城桃钙示踪研究

杨宪林1,2，赵庆章1，李 玲3，王 雷3，庞义俊1,2，王小明1，窦 亮1，张 慧1,4，杨旭冉1，武绍勇1，高东升3，孙科鹏3，周 君3，何 明1，董克君1，沈洪涛2，姜 山1

(1.中国原子能科学研究院，北京 102413；2.广西师范大学，广西 桂林 541004；3.山东农业大学，山东 泰安 271018；4. 黑龙江省科学院技术物理研究所，黑龙江 哈尔滨 150086)

为了探究桃树对钙离子的吸收、转运与分布规律，首次应用放射性核素41Ca示踪结合超灵敏的加速器质谱技术(AMS)研究山东肥城桃树果肉、叶片、多年生枝条等器官从果实膨大期到成熟期钙的输运规律以及成熟期果树各器官41Ca的分布状况。结果表明：通过树干注射硝酸钙(含41Ca)的方法可以有效为桃树补充钙剂，超过60%的钙剂储存在树干，从树干中部到上部41Ca分布逐渐减少；叶片、枝条、果肉等器官对钙离子吸收主要在幼果细胞分裂期，从果实膨大期到成熟期叶片、果肉中钙含量一直不断减少，而多年生枝条中钙含量从果实膨大期到成熟期前期不断减少而后期上升；成熟期桃树各器官41Ca分布结果表明蒸腾拉力大的器官中钙离子含量较高，其中新生器官中的钙离子含量新梢>果皮>果肉。由此可见，使用41Ca-AMS技术能够探究桃树对钙离子的吸收与分布规律，从而对桃树的科学补钙具有指导意义。

桃树；钙分布；41Ca；加速器质谱；树干注射

Abstract: The calcium deficiency has caused many problems such as browning, poor storability for Feicheng peach, which is great economic losses for Chinese farmers. It is very significant to research the transport rule of calcium in fruit trees. In order to study the absorption, translocation and distribution of calcium in peach, a technique of41Ca isotope tracer combined with AMS was developed and applied in the study. A field experiment was conducted to determine effects of injecting calcium fertilizer on tracer calcium content dynamic, calcium distribution of Feicheng peach to understand the rules of absorbing calcium and provides the theoretical basis in adding calcium nutrient and technical guidance. The experimental material is 11 years old Feicheng peach tree. Ca(NO3)2solution (including41Ca) was injected on selected Feicheng peach fruit flees at 2015.04.30 at the florescence. Then, about every 30 days, the peach tree’s different organs, such as new shoots, leaves, perennial branches, were collected. All the samples were prepared to CaF2and measured at HI-13 AMS at CIAE. The main results are follows: (1) More than 60% of41Ca were stored in the trunk and the41Ca distribution gradually decreased from bottom to top in trunk. (2) In young fruit stage, the calcium was mainly absorbed by organs such as leaves, branches, flesh mainly concentrated, however, from the fruit swelling period to the mature stage, calcium content in the leaves and flesh was declining, and the calcium content in the perennial branches had the same tendency at the beginning but it grew in the mature stage. (3) In mature stage, from August 4 to September 2 the distribution of41Ca of each organ showed that the organs’ calcium content was higher whose transpiration was greater and the calcium contents of new organs were as follows: new shoot>pericarp>flesh. It is feasible and easy to explore the peach tree for calcium absorption and distribution by using41Ca-AMS technology. And the rapidly calcium growing period of new shoots and leaves is at the florescence for trunk injection application of calcium. The best calcium absorption time was studied in order to provide a guidance. While there are some shortages in this experiment, such as the datum of root, new leaves for the limitation of targets in ion source were not got. In the future, a new and special facility to measure the41Ca can be built, so that more detailed study about the running rule of calcium ion in peach trees can be improved.

Keywords： peach; calcium distribution;41Ca; accelerator mass spectrometry (AMS); calcium distribution

钙元素是果树生长的必要元素之一，桃树缺乏钙会引起果顶软化，桃子裂果等一系列生理疾病[1]。为了防止这些疾病的发生，需要对桃树进行科学补钙。通过文献调研，对果树进行补钙的传统方式有四种[2]：根施技术、叶面喷钙、树干注射、采后浸钙。采用不同的补钙方法，果树对钙离子的吸收原理也不尽相同。树干注射是最常见的补钙方式之一，其原理是利用树木注射器或树木输液器的大气压差，在植物需钙高峰期将钙营养液直接输入树干木质部，利用植物吸水、蒸腾拉力对进入木质部的钙营养液进行运输、稀释、分配、转运到植物生长的各个部分，以人工强迫接受取式植物根系耗能吸收，从而克服了缺钙植物根系易受损及吸钙难的问题，也解决了喷施中钙再分配运输难、浸果钙进入难和易伤果的问题[3]。

放射性同位素示踪研究是探究果树钙离子分布的主要方式。自然界中钙元素有7种同位素(40Ca、41Ca、42Ca、43Ca、44Ca、46Ca、48Ca)，其中40Ca、42Ca、43Ca、44Ca、46Ca 和48Ca 属于钙的6种稳定同位素，它们广泛存在于自然界及生物体内，都不适用于进行生物体内示踪[4]，41Ca(1.03×105a)属于长寿命放射性核素，在自然界中丰度极低，过去由于分析仪器灵敏度低而鲜有应用。作为自然界中不存在的钙同位素(主要是在反应堆中由中子照射产生)，45Ca(162.61 d)、47Ca(4.356 d)具有本底干扰较小，测量方便的优势，是做钙示踪研究的首选核素。周卫、萧浪涛等[5-6]利用45Ca开展了苹果树及柑橘的示踪研究。但它们存在以下不足：1)47Ca半衰期太短，不适宜做果树的示踪研究；2)45Ca和47Ca衰变时产生电子和γ射线会造成辐射损伤。41Ca相比于45Ca、47Ca，具有辐射损伤小，半衰期长的特点。近年来发展的加速器质谱仪(AMS)是一种结合离子源、加速器、探测器等手段的核分析技术，该技术具有灵敏度高、测量时间短、样品用量少等优点，国内外已经利用41Ca-AMS技术在动物体内开展了诸多研究[7-9]。本工作拟采用41Ca对桃树进行示踪研究，应用AMS分析桃树样品各时期各器官的钙含量，希望为桃树科学补钙提供合理建议。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

HI-13加速器质谱仪(AMS)：中国原子能科学研究院提供；GSL1300型真空管式高温炉：沈阳科晶设备制造有限公司产品；5840R冰冻离心机：德国Eppendorf公司产品。

1.2 主要材料与试剂

本实验于2015年5月到2015年9月在山东农业大学果树试验基地进行。试材为11年生“红里肥城桃”桃树；41Ca示踪剂：由中国原子能科学研究院重水堆辐射获得，41Ca/Ca为4.20×10-5；标准样品41Ca/40Ca=(1.78±0.05)×10-8和空白样品。氨水、草酸铵：均为优级纯，北京化学试剂公司产品；浓盐酸、硝酸、氢氟酸：均为MOS级，北京化学试剂研究所产品；Dowex50W-X8强酸性阳离子交换树脂400目。

1.3 实验条件

使用HI-13加速器质谱仪分析41Ca时，各部分工作条件如下。

1.3.1离子源束流引出条件 阴极电压2.5 kV，铯溅射电压8.5 kV，铯聚焦电压1.0 kV，引出电压15 kV，铯锅温度95～100 ℃。

1.3.2束流传输条件 注入磁场3.18 kG，加速器端电压8.27 MV，高能分析磁铁8.07 kG，静电偏转电压144.54 kV。

1.4 实验方法

1.4.1桃树标记、样品制备与测量[10-11]

1) 示踪剂41Ca标记：2015年4月30日，称取30 mg含有41Ca的氧化钙样品，利用适量的硝酸溶解后用去离子水稀释至50 mL，利用pH试纸测量呈中性。然后利用手持电钻，在距离地面50 cm的高度，对树干进行打孔至木质部，然后利用注射器在打孔处滴注41Ca(NO3)2溶液，最后用黄泥封口。

2) 桃树各器官的收集：标记后每隔大约1个月对果实、叶片、多年生枝条进行取样，105 ℃杀青，75 ℃烘干；在成熟期，分别取完全展开的叶片、新梢、多年生枝、树干中部、树干、树干皮、枝皮、果肉、果皮等器官，105 ℃杀青，75 ℃烘干，用植物组织粉碎机研磨后待用。

3) 样品消解：精确称取1 g步骤(2)中的样品于250 mL烧杯中，加20 mL HNO3-H2O2(4∶1，V/V)混合酸消化液，上盖表面皿。置于电热板上加热消化至无色透明，加若干毫升去离子水，加热去除多余酸。待烧杯中液体蒸发近干时，取下冷却。

4) 草酸钙的制备：将冷却后的溶液用去离子水稀释至15 mL。加入等体积饱和草酸铵，必要时滴加氨水维持pH在10附近，混匀后静置3 h。以 3 600 r/min离心5 min， 倾 去 上 清 液，用2 mL 2.5%草酸铵和2 mL去离子水分别洗涤沉淀3次。烘干待用。

5) 氟化钙的制备：称量制备的草酸钙，并利用硝酸溶解，溶解后用去离子水稀释至15 mL,然后过400目阳离子交换玻璃柱，用硝酸冲洗2次，滴加适量氢氟酸后，离心，除去上清液，将沉淀烘干。

6) AMS测量：将制备的氟化钙称量并与氟化铅按照质量比4∶1压入靶锥进行测量，用同样的方法测量标准样品和空白样品。

1.4.2计算方法 桃树样品41Ca/40Ca=(桃树样品41Ca计数/桃树样品的束流强度)×(标准样品束流强度/标准样品41Ca计数)×1.78×10-8。单位质量各器官的41Ca/Ca=单位质量内样品41Ca/Ca的测量值-单位质量空白41Ca/Ca。41Ca分配率=(单位质量内某器官41Ca/Ca值/所测量单位质量内各器官41Ca/Ca总和)*100%。41Ca相对变化率=(第二次测量的41Ca丰度-第一次测量的41Ca丰度)/第一次测量的41Ca的丰度。

2 结果与讨论

实验采用标准样品(41Ca/40Ca=1.78×10-8)和被测量样品交替测量的方法，来避免系统误差，最后得到多次测量结果的平均值，误差按标准偏差计算。所有样品的测量时间为600 s。利用探测器测得所有样品的双维谱图示于图1。根据测得的41Ca计数与束流强度，计算得到桃树样品的41Ca/40Ca。

图1 流程空白(a)、标准样品41Ca/Ca =1.78×10-8(b)和桃树样品(c)中的双维谱图Fig.1 Spectra (E2-Er) of a blank (a), 41Ca/Ca=1.78×10-8 standard (b) and peach samples (c)

2.1 各时期枝条、叶片、果肉等器官钙含量变化

根据文献可知，肥城桃在生长过程中具有2次迅速膨大期(5月份和7月份)和1次硬核期(6月份)，果实中超过80%的钙的吸收发生在果实开始生长的细胞分裂期，这些钙首先通过果柄的韧皮部进入果实，然后通过木质部到达果实的各部分。自然界中41Ca/Ca的丰度约为10-15～10-14[12]，多年生枝条、叶片、果肉钙含量变化情况列于表1，6月初桃树各器官中的41Ca相比本底值有较大增加。因此，在5月初对树干进行注射补钙对果树可达到一定的补钙效果。

表1 多年生枝条、叶片、果肉钙含量变化Table 1 Calcium content change of perennial branches, leaves and fruit pulp

注：“/”表示当月没有采样

叶片中钙离子含量会受到叶面蜡质化程度、植物组织的生命活力、韧皮部运输的主导作用、 嫩叶激素的调控等因素的影响。而叶龄会影响叶片代谢活力、细胞膜通透性、角质层和蜡质层的组成[3]。据表1显示，在6月3日后叶片和果肉中钙含量均有下降，其中叶片中6月份下降30.78%，7、8月份下降47.26%。桃树不同时期叶片中41Ca的分布表明，随着叶龄的增加，对钙离子的吸收能力逐渐下降。根据彭永宏等人的研究结果[14]，叶片角质化程度高导致蒸腾作用受到削弱而不利于45Ca的转运，这与本实验的结果一致。

多年生枝条的41Ca含量在6月29日与6月3日相比下降89.53%；8月4日较6月29日下降62.82%；9月2日较8月4日增加了14.76倍。6月3日至6月29日，果核处于硬核期，该时期果核对钙离子需求较大，故多年生枝条中钙离子流失较快。8月4日到9月2日(成熟期)，多年生枝条41Ca含量增加，在蒸腾量过大或木质部钙含量低或氮素营养过剩条件下，低蒸腾的果实常常不能得到充足的钙离子供应，甚至发生果实钙向枝条转移的现象。表1中多年生枝条和果肉钙含量变化验证了该结论。

根据表1，果肉中41Ca含量变化：6月29日至8月4日，下降了 71.14%；8月4日至9月2日，下降14.19%；在整个生长期中果肉钙含量都有下降的趋势。此结果证明了果实超过80%的钙离子来源于幼果时期。与萧浪涛等[6]的报道中对45Ca的研究结果一致：后期外运超过了吸收占主导地位，表现为果实中的45Ca向枝叶中“倒流”。

2.2 肥城桃成熟期41Ca在体内的分布

有资料显示，钙离子在木质部输运过程中极易与树干导管细胞壁以及木质部周围薄壁细胞的细胞壁发生交换吸附和再吸收。尤其是刚注射后，由于木质部细胞壁上大量负电基团对二价钙离子的交换吸附，导管细胞壁大量吸附钙元素，相当于在树干中建立一个钙元素库，因而可以持续不断地向叶片和果实供应钙。导管壁对钙离子的吸附，减慢了钙离子向上运输的速度，是树干中钙离子储存的主要原因[13]。此外，上部茎含水量高，对钙的稀释效应大，这也可能是导致其积累量低于下部树干的因素之一[14]。肥城桃在成熟期41Ca的分布列于表2。可见，钙离子主要储存在树干中(约占总体的60%)，树干中部41Ca的丰度比树干上部高，可以间接验证以上结论。

表2 果实成熟期各器官41Ca分布Table 2 The different organs’ 41Ca distribution in fruit mature period

叶片、枝条的蒸腾拉力比新生器官相对较高，故41Ca的分布与积累更多，从而证明钙的分配量与蒸腾率成正相关。新生器官中41Ca分布状况为：新梢>果皮>果肉，这表明桃树中各器官对钙的输运能力存在明显差异，主要原因可能是：1)植物体内钙的运输主要依赖蒸腾作用通过木质部导管及导管壁交换位点进行，难以通过韧皮部向新生长区转运[5]；2)钙可与生长素逆向运输，产生生长素多的部位，对钙的竞争力强，果实营养梢生长过旺时，生长素的产生远多于果实，引起新生茎叶与果实竞争钙[15]。一旦钙在某一组织中沉淀下来，大都固定不动，难以重新转运。老叶钙含量高，幼叶中低；茎叶中高，果实中低[16]。

随着果实的膨大，钙的浓度被稀释，由于果实蒸腾作用弱，对钙的积累相对较少[17]，41Ca示踪实验显示，果肉的41Ca丰度占所测各器官41Ca丰度的1.12%，成熟期树干皮、枝皮等器官41Ca丰度不足1%，二者结果很接近，证明在果实成熟阶段，由木质部供应的钙减少，果实需要的钙主要靠韧皮部提供。作为后期果实钙输运的主要器官，韧皮部主要受昼夜转换和环境湿度影响，受蒸腾作用影响较小。

3 结论

采用41Ca-AMS技术，完成了树干注射法桃树钙离子示踪实验。根据果实膨大期到成熟期41Ca的实验数据初步得出以下结论：利用树干注射方法，在开花后期对肥城桃进行补钙能够有效增加果肉的钙含量；蒸腾强度较大和生长时间较长的器官，例如枝条、叶片，比其他器官的钙分布较多；从第一次果实膨大期开始，果肉的钙含量一直处于减少趋势。实验中由于靶位限制未能精确推测出果实吸收钙的最佳时间，同时本实验未检测果核、新叶、树干底部及根部等器官的数据，接下来可以利用该方法进一步探究钙离子在桃树以上各器官中的详细转运规律，以及不同钙剂、不同补钙方式作用下桃树对钙的吸收差异性，从而为桃树的科学补钙提出更加详细、合理的建议。

致谢：感谢山东农业大学提供的样品，同时感谢北京串列加速器国家实验室工作人员对束流稳定付出的努力。

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Calcium Tracer Study of Feicheng Peach by41Ca-AMS

YANG Xian-lin1,2, ZHAO Qing-zhang2, LI Ling3, WANG Lei3, PANG Yi-jun1,2,WANG Xiao-ming1, DOU Liang1, ZHANG Hui1,4, YANG Xu-ran1, WU Shao-yong1, GAO Dong-sheng3, SUN Ke-peng3, ZHOU Jun3, HE Ming1, DONG Ke-jun1, SHEN Hong-tao2, JIANG Shan1

(1.ChinaInstituteofAtomicEnergy,Beijing102413,China; 2.GuangxiNormalUniversity,Guilin541004,China；3.ShandongAgriculturalUniversity,Tai’an271018,China；4.TechnicalPhysicsInstituteofHeilongjiangAcademyofSciences,Harbin150086,China)

O657.63

A

1004-2997(2017)05-0534-07

10.7538/zpxb.2016.0141

2016-08-29;

2016-11-20

国家自然科学基金项目(11375272，11265005，11565008) 资助

杨宪林(1989—)，男(汉族)，河南商丘人，硕士研究生，粒子物理与原子核物理专业。E-mail: yangxl@stu.gxnu.edu.cn

姜 山(1956—)，男(汉族)，河北青龙人，研究员，从事加速器质谱研究。E-mail: jiangs@ciae.ac.cn