杜仲补肾健骨颗粒对胫骨截骨兔Ilizarov胫骨延长手术效果的影响及其机制

王金国，房经武，郑祺，闫秀中，丁林，王雨

(1日照市中医医院，山东日照276800；2日照市疾病预防控制中心)

杜仲补肾健骨颗粒对胫骨截骨兔Ilizarov胫骨延长手术效果的影响及其机制

王金国1，房经武1，郑祺2，闫秀中1，丁林1，王雨1

(1日照市中医医院，山东日照276800；2日照市疾病预防控制中心)

目的探讨杜仲补肾健骨颗粒对胫骨截骨兔Ilizarov胫骨延长手术后骨折愈合的影响及其机制。方法将64只新西兰大白兔随机分为观察组和对照组，每组32只。两组均建立左下肢胫骨截骨模型，建模5天行Ilizarov胫骨延长术，延长速度为每天1 mm，分两次完成，连续延长20天(共延长20 mm)。延长结束后观察组给予杜仲补肾健骨颗粒1.6 mL/(kg·d)灌胃，1次/d，共8周；对照组给予等量生理盐水灌胃。两组分别于延长结束即刻(给药前)及给药2、4、8周随机选取8只兔，采用ELISA法检测血清骨钙素水平；处死后观察延长区骨化情况、组织形态学改变，测量骨小梁面积百分比。采用双能X线骨密度仪检测两组给药8周左下肢骨密度(BMD)。结果两组给药2、4、8周血清骨钙素水平、骨小梁面积百分比均较给药前升高，且观察组同时间点较对照组升高更明显(P均<0.01)。两组给药前延长区均未见明显骨化，其成分均为致密结缔组织，未观察到骨组织；给药2、4、8周，观察组成熟骨性骨痂形成时间早于对照组，骨化情况优于对照组。观察组及对照组左下肢BMD分别为(0.134 8±0.007 2)、(0.079 5±0.004 7)g/cm2，两组比较P<0.05。结论杜仲补肾健骨颗粒可促进骨折愈合，提高兔Ilizarov胫骨延长术的手术效果；提高血清骨钙素水平及BMD、促进成骨细胞活性及骨痂矿化可能是其作用机制。

胫骨骨折；Ilizarov技术；骨延长；骨愈合；杜仲补肾健骨颗粒；中药；骨痂矿化；骨钙素；兔

Ilizarov技术为临床常用的骨延长技术。Ilizarov外固定支架具有空间立体结构，可从多个方向调节骨折成角及移位，具有固定牢固、轴向加压、早期允许适当负重的特点，广泛应用于长骨骨折不愈合、骨折畸形愈合及骨缺损等疾病的治疗[1]。但Ilizarov术后骨延长1.0 mm需要1～2个月，延长5.0 mm需要6个月左右，骨折愈合缓慢，导致并发症发生率升高[2]。中医认为，肾虚血瘀是骨折延迟愈合的重要病机，杜仲补肾健骨颗粒具有补肾益气、活血化瘀的作用，但是关于其是否有助于Ilizarov骨延长术后骨折愈合的研究较少[3,4]。2016年8～12月，本研究观察了杜仲补肾健骨颗粒对兔Ilizarov胫骨延长手术效果的影响，现分析结果并探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料 动物：健康普通级新西兰大白兔64只，雌雄各半，1岁龄左右，体质量2.2～3.8(3.03±0.52)kg，由潍坊医学院实验动物中心提供。主要药品及试剂：杜仲补肾健骨颗粒(方剂组成：杜仲、熟地、骨碎补、补骨脂、黄芪各12 g，山茱萸、枸杞子、菟丝子、淫羊藿、当归、白芍、丹参、桃仁、红花、牛膝各9 g)由日照中医医院制剂室制成，按照每10副中药加水6 000 mL，以煎药机煎煮20 min后去药渣浓缩至2 500 mL，制备成每100 mL含生药60 g的溶剂，袋装封存备用。骨钙素ELISA检测试剂盒购于丹麦Osteometer Bio Tech公司。主要仪器：lizarov外固定支架购于扬州市尖新医疗器械有限公司，双能X线骨密度仪购于企晟(上海)医疗器械有限公司。

1.2 胫骨截骨模型制备及手术方法 64只新西兰大白兔适应性喂养1周，制备胫骨截骨模型。制备方法：术前禁食，采用1%戊巴比妥3 mg/kg静脉麻醉。以左下肢作为手术肢，使用电钻在胫骨结节上方处交叉钻入2枚直径为1.2 mm的克氏针，胫骨远端同样交叉钻入2枚克氏针；分别将克氏针固定于Ilizarov外固定架的环上，调整外固定支架使其固定平行。于上、下克氏针中间取胫骨前外侧纵行切口，显露胫骨上端，撬断腓骨下端，完全截断胫骨。调整Ilizarov外固定支架，使胫骨骨折断端保持解剖复位，缝合骨膜，关闭切口。术后常规应用抗生素，刀口及针道采用安尔碘湿敷抗感染。 制模后采用随机数字表法将64只模型兔分为观察组和对照组，每组32只。两组均于建模5 天行Ilizarov胫骨延长术[5]，延长速度为每天1 mm，分两次完成，连续延长20天(共延长20 mm)。延长结束后固定。

1.3 杜仲补肾健骨颗粒干预 手术结束时观察组给予杜仲补肾健骨颗粒1.6 mL/(kg·d)灌胃，1次/d，共8周(根据Meeh-Rubner公式按照体表面积计算给药剂量)；对照组给予等量生理盐水灌胃，1次/d，共8周。

1.4 相关指标观察 ①血清骨钙素水平：两组分别于延长结束即刻(给药前)及给药2、4、8周时随机选取8只兔，空腹12 h后心脏穿刺取血2 mL，离心后分离血清，采用ELISA法检测血清骨钙素水平，严格按照试剂盒说明书操作。②延长区骨化情况、组织形态学改变及骨小梁面积百分比：血清骨钙素水平检测完成后采用颈动脉放血法将随机选出的8只兔处死，取出左下肢胫骨，对延长区组织常规进行石蜡包埋、切片、固定及HE染色，50倍显微镜下观察组织形态学改变，采用IPP Mediaplayer形态计量软件测量骨小梁面积百分比。③骨密度(BMD)：给药8周处死后、分离左下肢胫骨前，采用双能X线骨密度仪检测两组左下肢BMD。

2 结果

2.1 两组血清骨钙素水平比较 两组给药2、4、8周时血清骨钙素水平均较给药前升高，且观察组同时间点较对照组升高更明显(P均<0.01)。见表1。

表1 两组血清骨钙素水平比较

注：与同组给药前比较，*P<0.01；与对照组同时间点比较，#P<0.01。

2.2 两组延长区骨化情况、组织形态学改变比较 给药前：两组均未见明显骨化，其成分均为致密结缔组织，未观察到骨组织。给药2周：观察组可见大量骨化，其成分为大量纤维性骨痂为主的类骨质；对照组可见少量骨化，其成分大部分为纤维组织，可见少量骨痂形成。给药4周：观察组可见完全骨化，其成分主要为成熟骨；对照组可见大量骨化，其成分主要为类骨质。给药8周：观察组可见完全骨化，其成分主要为成熟骨性骨痂；对照组可见完全骨化，其成分主要为纤维性骨痂和骨性骨痂，可见少量成熟骨陷窝及骨细胞。

2.3 两组骨小梁面积百分比比较 两组给药2、4、8周骨小梁面积百分比均较给药前升高，且观察组同时间点较对照组升高更明显(P均<0.01)。见表2。

表2 两组骨小梁面积百分比比较

注：与同组给药前比较，*P<0.01；与对照组同时间点比较，#P<0.01。

2.4 两组左下肢BMD比较 观察组左下肢BMD为(0.134 8±0.007 2)g/cm2，对照组为(0.079 5±0.004 7)g/cm2，两组比较P<0.05。

3 讨论

1969年，Ilizarov教授通过对骨和软组织牵拉应力作用下的再生机制进行研究，提出了牵拉组织再生的生物学理论，认为在张力-应力刺激下，组织生长、细胞增殖、生物合成等功能更加旺盛[7]。根据Ilizarov原则，生物组织在持续稳定缓慢牵张过程中产生一定张力，激活组织细胞再生和活跃生长，骨和软组织在缓慢牵拉产生的张应力作用下可发生再生和重建[8]。Ilizarov外固定支架具有空间立体结构，通过框架结构既可牢固固定，又可克服应力遮挡，在体外可通过调节螺母达到纠正侧方移位、成角和旋转畸形的目的，广泛用于肢体畸形纠正和肢体延长[9]。但Ilizarov技术治疗后存在骨愈合缓慢，术后带架周期长，易发生感染、骨折延迟愈合等并发症的缺点[10]。秦泗河[11]认为，在采用Ilizarov技术进行肢体延长及牵拉组织再生的过程中，促进局部组织血液循环和氧气供应有助于骨组织再生。

中医认为“肾主骨，生髓”，该理论居于中医骨伤科诊断治疗的核心地位；骨折多为本虚标实之证，瘀阻是病机的关键环节，肾虚是病理基础，肾虚血瘀为骨折常见证型，宜补肾益气、活血化瘀[12]。杜仲补肾健骨颗粒以杜仲补肝肾、强筋骨，熟地黄补血养阴、益精填髓，二者合用，阴阳并补，补益肝肾、壮筋健骨，共为君药。淫羊藿补肾壮阳、祛除风湿；骨碎补温补肾阳，强筋健骨，且能活血续伤；枸杞子滋补肝肾；山茱萸补肝养血、益肾涩精；菟丝子辛以润燥，甘以补虚，为平补阴阳之品，补肾阳，益肾精，共为臣药。当归活血调经，养血补肝，与补肾之品合用共补精血；丹参、白芍养血活血，祛瘀止痛；桃仁、红花活血祛瘀，消肿止痛；黄芪性微温，味甘，归脾肺经，可健脾补中，升阳举陷，补益后天之精以滋养先天之精，且气旺则血行，与活血药相配，益气活血，诸药共为佐药。牛膝归肝肾经，补肝肾，强筋骨，活血利水，具有走而能补，性善下行之特点；与当归、白芍、桃仁、红花等活血药相配，则引血下行，活血祛瘀；与诸补益肝肾之药相配则能引药归经，既能活血祛瘀，又能补益肝肾，强筋健骨，是为使药。全方共具补肾生骨、益肝健脾、活血通络的作用。

本研究结果显示，观察组给药2、4、8周骨化情况及组织学观察结果均优于对照组，骨小梁面积百分比均高于对照组，说明杜仲补肾健骨颗粒可促进骨折愈合。本研究观察组给药8周左下肢BMD高于对照组，说明杜仲补肾健骨颗粒具有提高BMD、促进骨痂矿化的作用。骨钙素为成骨细胞分化时分泌的非胶原蛋白质，是成骨细胞特异性产物，又称骨钙蛋白，可准确反映成骨细胞活性。骨钙素可参与体内钙调节，促进骨生成过程中基质钙化，加速骨痂矿化，促进骨折愈合[13]。本研究结果显示，两组给药2、4、8周时血清骨钙素水平均较给药前升高，且观察组同时间点较对照组升高更明显，说明提高血清骨钙素水平以促进骨痂矿化可能是杜仲补肾健骨颗粒促进骨折愈合的重要作用机制之一。

综上所述，杜仲补肾健骨颗粒可促进骨折愈合，提高兔Ilizarov胫骨延长术的手术效果；提高血清骨钙素水平及BMD、促进成骨细胞活性及骨痂矿化可能是其作用机制。

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2017-05-25)