甲状腺乳头状癌组织中TSHR、NIS基因启动子区甲基化状态与临床病理特征的关系

王占龙，封凯

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院，内蒙古包头014010)

甲状腺乳头状癌组织中TSHR、NIS基因启动子区甲基化状态与临床病理特征的关系

王占龙，封凯

(内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院，内蒙古包头014010)

目的探讨甲状腺乳头状癌(PTC)组织中促甲状腺激素受体(TSHR)与钠碘转运体(NIS)基因启动子区甲基化状态与临床病理特征的关系。方法收集80例PTC患者临床资料及手术病理标本石蜡切片，采用实时荧光定量甲基化特异性PCR(qMSP)法检测TSHR和NIS启动子区甲基化状态，分析二者与患者临床病理特征的关系。结果PTC组织中TSHR与NIS基因启动子区甲基化发生率分别为71.25%、32.50%，癌旁正常组织中分别为8.75%、6.25%，两者比较差异有统计学意义(P均<0.05)；不同年龄、性别、肿瘤直径PTC患者癌组织中TSHR与NIS基因启动子区甲基化情况比较无明显统计学差异(P均>0.05)，病灶多发、腺外侵犯、有颈部淋巴结转移、临床分期Ⅲ～Ⅳ期PTC患者癌组织中TSHR与NIS甲基化程度高于病灶单发、局限腺内、无颈部淋巴结转移及临床分期Ⅰ～Ⅱ期者(P均<0.05)。Spearman相关分析显示，PTC组织中TSHR与NIS基因启动子区甲基化呈正相关(r=0.532，P<0.05)。结论PTC组织中TSHR与NIS基因启动子区甲基化现象普遍存在，与病灶多发、颈部淋巴结转移、腺外侵犯、临床分期关系密切，两个基因启动子区域甲基化协同作用可能是引起肿瘤发展及转移的相关机制之一。

甲状腺乳头状癌；促甲状腺激素受体；钠碘转运体；启动子；甲基化；病理特征

甲状腺癌是最常见的内分泌系统恶性肿瘤，也是世界上发病率增速较快的恶性肿瘤之一[1～3]，在我国肿瘤发病率中位居第10位。根据组织学类型和细胞来源等特征，甲状腺癌可分为甲状腺滤泡状癌(FTC)、甲状腺乳头状癌(PTC)、甲状腺低分化型癌(PDTC)、甲状腺未分化癌(ATC)。其中，PTC最为常见，占到80%左右，其发病机制尚不完全清楚。但是，临床相关研究显示促甲状腺激素受体(TSHR)与钠碘转运体(NIS)与甲状腺癌的发生及发展关系密切[4～7]。TSHR是甲状腺特异蛋白，与TSH结合后可激活细胞内信号通路传导途径来发挥对碘代谢的调节作用。本研究对PTC组织中TSHR与NIS基因启动子区甲基化状态与临床病理特征的关系进行了研究，旨在分析二者在PTC发病中所起的作用。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入标准：①术后经病理确诊为原发性PTC；②术前未行放疗、化疗等治疗；③未合并其他恶性肿瘤；④患者临床资料完整，手术病理标本石蜡切片完整。收集2011年1月～2016年6月在包头医学院第一附属医院行甲状腺癌根治术的80例PTC患者，男12例，女68例；年龄(46.98±4.10)岁，其中≤45岁46例、>45岁34例；单发病灶46例，多发病灶34例；肿瘤直径≤2 cm 57例，肿瘤直径>2 cm 23例； 腺外侵犯36例，局限腺内44例；颈部淋巴结转移(包括气管前淋巴结转移)34例，无淋巴结转移46例；临床分期Ⅰ～Ⅱ期52例，Ⅲ～Ⅳ期28例。

1.2 TSHR与NIS基因启动子区甲基化检测方法

1.2.1 DNA提取 每例患者选取3～5张病理标本石蜡切片，包括癌组织及癌旁开3 mm之外的正常组织；进行苏木精及伊红染色、洗涤，在37 ℃下温箱内干燥过夜。100%的二甲苯溶液进行脱蜡15～30 min，循环5次；采用100%、85%的乙醇溶液梯度洗脱15 min，再用ddH2O水化处理10 min；在显微镜下观察及寻找癌细胞及癌旁正常细胞，获取约4 000个目标细胞；以DNA提取试剂盒(Qiagen公司)提取DNA，操作严格按照试剂盒操作说明进行。

1.2.2 甲基化测定 采用实时荧光定量甲基化特异性PCR(qMSP)法。以DNA亚硫酸氢盐修饰试剂盒(Qiagen公司)对DNA进行亚硫酸钠修饰及纯化回收，参考文献[8]根据TSHR和NIS基因序列设计CpG岛特异甲基化和非甲基化引物；采用ABI 7500PCR仪对修饰后的DNA进行分析，根据测得的Ct值和标准曲线计算DNA甲基化百分率(M%)。M%=甲基化DNA拷贝数/(甲基化DNA拷贝数+非甲基化DNA拷贝数)×100%，M%>20.00%为甲基化，其中>80%为完全甲基化、20%～80%为部分甲基化、<20%为非甲基化。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0统计软件。计数资料比较采用χ2检验，相关性分析采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PTC组织与癌旁正常组织中TSHR与NIS基因启动子区甲基化情况比较 PTC组织中TSHR与NIS基因启动子区甲基化发生率分别为71.25%(57/80)、32.50%(26/80)，癌旁正常组织中分别为8.75%(7/80)、6.25%(5/80)，两者比较差异有统计学意义(P均<0.05)。

2.2 TSHR与NIS基因启动子区甲基化与PTC临床病理特征的关系 不同年龄、性别、肿瘤直径PTC患者癌组织中TSHR与NIS基因启动子区甲基化情况比较，差异无统计学意义(P均>0.05);病灶多发、腺外侵犯、有颈部淋巴结转移、临床分期Ⅲ～Ⅳ期PTC患者癌组织中TSHR与NIS甲基化程度高于病灶单发、局限腺内、无颈部淋巴结转移及临床分期Ⅰ～Ⅱ期者，且差异有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 TSHR与NIS基因启动子区甲基化与PTC临床病理特征的关系(例)

2.3 PTC组织中TSHR与NIS基因启动子区甲基化的相关性 Spearman相关分析显示，PTC组织中TSHR与NIS基因启动子区甲基化呈正相关(r=0.532，P<0.05)。

3 讨论

PTC的发病机制尚不完全清楚，可能与激素作用、基因改变、环境影响等有关[1～3,9]。其中，研究明确的PTC相关的分子事件有转染重排基因/PTC基因的重排、碘代谢相关基因TSHR和NIS启动子的异常甲基化、v-raf鼠类肉瘤滤过性病毒致癌基因同源体B1的V600E点突变及miR-31、miR-222等异常表达[8]。

TSHR属于G蛋白偶联受体，定位在14q13，主要表达在甲状腺滤泡细胞基底外侧膜上[10～13]，可与其配体TSH结合，刺激细胞生长及分化，促进甲状腺素合成，可直接促进甲状腺组织对碘的摄取。NIS主要分布在甲状腺滤泡上皮细胞的基底膜，可通过钠钾离子交换形成的浓度梯度来将细胞外血液中的碘离子从细胞外转运到甲状腺滤泡细胞中，是限制甲状腺激素合成的主要影响机制[14～16]，定位在19p13。临床研究[8]发现，DNA启动子区CPG岛的异常甲基化是引起TSHR与NIS基因失活的最常见原因，在甲状腺癌组织中均存在TSHR与NIS基因的甲基化失活现象，TSHR与NIS基因的甲基化参与了甲状腺癌的早期癌变过程。有研究[8]显示，TSHR甲基化的发生可能是由于TSHR蛋白表达减弱导致，这种表达异常可能是由于BRAF基因突变所致。TSHR蛋白表达异常使得甲状腺组织摄取碘的功能发生异常，可能引起组织发生癌变及恶性程度的增加。甲状腺细胞中的TSHR可与部分蛋白质相互作用，进行支持信号的传导，如钙连接蛋白、钙网蛋白、纤连蛋白等，这些蛋白基因突变可对信号通路形成异常影响。NIS负责甲状腺滤泡上皮细胞及癌细胞的碘摄取，出现失活可引起甲状腺癌的发生及病程进展。其功能失活的可能机制是NIS蛋白和mRNA表达绝对量的下调和表达绝对量的升高引起细胞膜到细胞质的异位，最终影响到碘的摄取。

长期以来，对恶性肿瘤的侵袭性进行准确判断是选取手术治疗的关键，如能明确恶性肿瘤的侵袭性高低，可避免不加选择的对恶性肿瘤患者进行“过度治疗”现象，如何选取合适的“肿瘤标记物”在术前对肿瘤恶性程度及侵袭性进行判断，值得关注。高侵袭性的甲状腺癌一般存在局部淋巴结的转移和多发病灶等表现，同时进展较快。有研究显示,TSHR与NIS基因的甲基化程度可反映出PTC的侵袭性[17,18]，为甲状腺癌的诊断和治疗提供参考。本研究对PTC组织中TSHR与NIS基因启动子区甲基化状态与临床病理特征的相关性进行了研究，结果显示PTC组织中TSHR与NIS基因启动子区甲基化的发生率高于癌旁正常组织，提示TSHR与NIS基因启动子区甲基化确实与甲状腺乳头状癌发生有关。在正常甲状腺组织中，TSHR与NIS基因启动子区甲基化现象并不严重，但是也有甲基化现象。分析PTC患者临床病理特征与TSHR与NIS基因启动子区甲基化的关系，结果显示患者年龄、性别、肿瘤直径不同时TSHR与NIS基因启动子区甲基化发生率无明显差异性，但是病灶多发、有腺外侵犯、有颈部淋巴结转移、临床分期Ⅲ～Ⅳ期时甲基化发生率高于无以上状况者，而以上现象均提示患者肿瘤细胞侵袭性较强。因此，TSHR与NIS基因启动子区甲基化程度与PTC患者病情关系密切，也可能是引起肿瘤侵袭的可能机制之一。分析TSHR与NIS基因启动子区甲基化之间的相关性，发现PTC组织中二者呈正相性，说明以上两种基因的甲基化可能是平行存在的。陆晓筱等[8]研究也显示，PTC组织中hMLH1、NIS和TSHR基因异常甲基化是普遍存在的，但他们之间不存在相关性，是独立、协同的对PTC的进展进行了影响。

综上所述，PTC组织中TSHR与NIS基因启动子区甲基化现象普遍存在，与病灶多发、颈部淋巴结转移、腺外侵犯、临床分期关系密切，两个基因启动子区域甲基化协同作用可能是引起肿瘤发展及转移的相关机制之一。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.34.028

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B

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2017-02-03)

封凯(E-mail: sunny_1806@126.com)