不同促排卵与激素替代治疗方案对人种植窗期子宫内膜LIF、IL-1β与整合素αVβ3表达的影响*

谭 丽,刘昕媛,楚喜英,卢 娜,项云改,宋玉霞,李朋粉

郑州大学第二附属医院生殖中心 郑州 450014

不同促排卵与激素替代治疗方案对人种植窗期子宫内膜LIF、IL-1β与整合素αVβ3表达的影响*

谭 丽△,刘昕媛,楚喜英,卢 娜,项云改,宋玉霞,李朋粉

郑州大学第二附属医院生殖中心 郑州 450014

诱发排卵；控制性超促排卵；激素替代治疗；子宫内膜容受性

目的：探讨诱发排卵、控制性超促排卵(COH)、激素替代治疗(HRT)方案对人种植窗期子宫内膜容受性的影响。方法选取60例取消移植的患者作为研究对象。20例为自然周期排卵，10例为诱发排卵，20例为COH方案，10例采用HRT方案。每个方案分别于排卵后第5、6天(D5、D6)采集半数研究对象的内膜，免疫组化SP法检测LIF、IL-1β与整合素αVβ3蛋白的表达。结果相同方案的D5与D6内膜间比较，3种蛋白的表达量差异均无统计学意义(P>0.05)。诱发排卵组、COH组、HRT组3种蛋白在内膜中的相对表达量均低于自然周期组，其中诱发排卵组最低，HRT组高于COH组(P<0.05)。结论HRT方案对人种植窗期子宫内膜容受性的影响最小。

辅助生育技术已经问世三十余年，但是临床妊娠率仍然偏低(30%～60%)[1]。辅助生育技术中所用的诱发排卵、控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)、激素替代治疗(hormone replacement therapy，HRT)等方案可能会使患者体内的性激素超出生理水平，从而降低子宫内膜容受性，导致妊娠失败。因此，近年来子宫内膜容受性成为生殖领域的研究热点。胚胎着床是通过多种免疫因子、细胞因子、黏附分子等的调控来完成的[2]，例如白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、整合素αVβ3等。多项研究[3-5]表明，上述因子在子宫内膜中的高表达时间与种植窗开放时间同步，因此可以认为其是子宫内膜容受性的标志物。该研究以LIF、IL-1β及整合素αVβ3为观察指标，比较了诱发排卵方案、COH方案以及HRT方案对人种植窗期子宫内膜容受性的影响，为优化临床用药方案提供更加可靠的理论依据。

1 对象与方法

1.1研究对象纳入标准：女方年龄22～30岁，基础内分泌在正常范围，月经周期规律(27～33 d)，不孕原因为输卵管因素和(或)男方因素，近3个月内无宫腔操作史，未服用激素类药物，术前签署经伦理委员会批准的知情同意书。排除标准：阴超提示子宫内膜不均或息肉，采样日内膜厚度<8 mm，宫腔积液、积血，子宫内膜异位症与子宫腺肌病，女方染色体异常等疾病，标本送病检结果异常，输卵管造影或B超提示输卵管积水。根据上述纳入和排除标准，选取2014年6月至2015年12月于郑州大学第二附属医院生殖中心经诱发排卵后因卵泡发育多而改行体外受精(invitrofertilization，IVF)/卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)助孕，取卵后取消移植的患者；或经COH长方案促排卵后接受IVF/ICSI助孕，取卵后为预防卵巢过度刺激取消移植的患者；以及经HRT方案调节子宫内膜，但本周期取消冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，FET)的患者(胚胎解冻后，因损伤无胚胎可移植或因患者社会原因而无法移植者)。以月经周期规律、排卵正常、未用任何药物者为对照。

1.2试验分组①对照(自然周期)：月经第10天开始连续阴超监测卵泡发育，排卵后第5、6天采集内膜，分别为自然周期D5组、自然周期D6组，每组各10例。② HRT：10例采用HRT方案。月经第2天开始口服雌二醇(E2)片4 mg/d，第8天加量至6 mg/d，第10天开始监测子宫内膜厚度，当内膜厚度≥8 mm时(月经第15～19天)加用黄体酮肌内注射80 mg/d，连续6 d，于加用黄体酮后第5、6天取子宫内膜，分别为HRT D5组、HRT D6组，每组各5例。③ COH：20例采用COH方案。黄体中期开始垂体降调节，皮下注射短效曲普瑞林(达必佳，辉林制药)0.1 mg/d，7 d后减为0.05 mg/d，降调14 d后加用促性腺激素(gonadotrophin,Gn)，肌内注射FSH 150～225 IU/d，适时添加HMG，Gn总量不超过300 IU/d。当3个以上卵泡直径≥18 mm时停用达必佳和Gn，并于当晚肌内注射HCG 10 000 IU，36 h后取卵，取卵后肌内注射黄体酮80 mg/d，直至样本采集。于取卵后第5、6天取子宫内膜组织，分别为COH D5组、COH D6组，每组各10例。④诱发排卵：10例采用诱发排卵方案。月经第5 天开始肌内注射Gn(FSH或HMG)150 IU/d，灵活调整用量，一般不超过225 IU/d。当2个以上卵泡直径达18 mm且出现LH峰时停用Gn，当晚肌内注射HCG 5 000～10 000 IU，36 h后取卵，取卵后肌内注射黄体酮60 mg/d，直至样本采集。取卵后第5、6天取子宫内膜分别为诱发排卵D5组、诱发排卵D6组，每组5例。

1.3标本采集患者取截石位，常规外阴、阴道与宫颈消毒，探针探查宫腔，随后用子宫内膜取样器在宫腔中上段抽吸少量内膜组织，经无菌生理盐水漂洗后，分成两份，一份送病理检查，一份用于LIF、IL-1β、整合素αVβ3 的检测。

1.4子宫内膜组织中LIF、IL-1β、整合素αVβ3的检测子宫内膜组织标本取材后迅速固定于甲醛溶液中，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋制成蜡块，然后4 μm厚切片，进行SP法免疫组化染色，按试剂盒(美国Santa Gruz公司、武汉博士德生物工程有限公司)说明操作。依次二甲苯脱蜡，高至低浓度乙醇复水，抗原热修复，滴加体积分数3% H2O2以消除内源性过氧化物酶活性，滴加正常山羊血清，封闭内源性生物素，滴加一抗及生物素标记的二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司，抗体稀释度为1100)，滴加辣根酶标记的链霉卵白素液，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察结果。用PBS代替一抗作阴性对照。胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。浅棕黄色、棕黄色、深棕黄色着色分别判定为弱阳性、阳性、强阳性。每张切片选择5个高倍视野(×400)，采用Biosens Digital Imaging System v1.6测定细胞内阳性区积分光密度(integral optical density，IOD)值，计算5个视野的IOD平均值，用来表示目的蛋白的相对表达量。

1.5统计学处理采用SPSS 22.0处理数据。4个处理组间目的蛋白相对表达量的比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验；同一处理D5组和D6组的比较采用两独立样本t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1各组间一般情况的比较8组内膜经病理检查，均确定为分泌期内膜，未见特殊病理情况。8组年龄、不孕年限、BMI、基础FSH以及取样日内膜厚度差异均无统计学意义，见表1。

表1 各组间一般情况的比较

2.2子宫内膜组织中LIF、IL-1β、整合素αVβ3的表达情况3种蛋白均主要表达于子宫内膜的腔上皮与腺上皮细胞的胞浆中。在诱发排卵组与COH组中染色为浅棕黄色，呈弱阳性表达；在HRT组中染色为棕黄色，呈阳性表达；在自然周期组中染色为

表2 子宫内膜组织中LIF的相对表达量

*:与自然周期比较，P<0.01；#:与HRT比较，P<0.01；△:与COH比较，P<0.01。

深棕黄色，呈强阳性表达。子宫内膜组织中3种蛋白表达的比较见表2～4。各处理方案D5和D6间比较，3种蛋白的相对表达量差异均无统计学意义(P<0.05)。3种蛋白的表达量为诱发排卵

表3 子宫内膜组织中IL-1β的相对表达量

*:与自然周期比较，P<0.01；#:与HRT比较，P<0.01；△:与COH比较，P<0.01。

表4 子宫内膜组织中整合素αVβ3的相对表达量

*:与自然周期比较，P<0.01；#:与HRT比较，P<0.01；△:与COH比较，P<0.01。

3 讨论

3.1不同用药方案对子宫内膜容受性的影响卵巢分泌的E2与孕酮(P)是调节子宫内膜发育的最基本因素。有学者[5]指出，排卵前适度的E2与排卵后P的黄体支持是内膜容受性建立的基础，合适的E2/P比例及P持续影响的时间是关键所在。

诱发排卵方案是在早卵泡期就给予Gn进行促排卵。在大量激素作用下，体内E2在早期就开始远远超过生理水平，这使得卵泡期LH过高、内源性LH峰提前，相应的P含量也会提前升高，导致E2/P比例不当，因此会损伤子宫内膜容受性。

COH中，标准的GnRH-α长方案开始于超排卵之前，在前一月经周期的黄体中期即开始应用GnRH-α进行垂体降调节，抑制了LH峰的出现，改善了卵子的质量，因此对种植窗和子宫内膜容受性有所改善。黄荷凤等[6-7]的研究结果显示，经过GnRH-α预处理后行超排卵，黄金地鼠的子宫内膜种植窗期与自然周期基本相似；而未经其预处理的单一PMSG超排卵的黄金地鼠种植窗期与自然状态差距明显。这也说明COH(GnRH-α长方案)与单纯超排卵相比，对于子宫内膜容受性的伤害更小。

HRT是模拟人的自然生理周期，使用雌孕激素序贯疗法来调节子宫内膜厚度及形态，以达到开放种植窗的目的。此方案可使体内E2/P比例达到较适宜的水平，与超排卵及COH方案相比，更接近生理水平，避免了超高量的激素所产生的严重不良影响。但HRT中的激素水平可能仍会比自然周期稍高，在一定程度上影响子宫内膜容受性。

该研究结果显示：诱发排卵组、COH组、HRT组子宫内膜组织中LIF、IL-1β及整合素αVβ3的相对表达量均低于自然周期组，且诱发排卵组最低，而HRT组高于COH组，说明这三种方案均会降低子宫内膜容受性，但HRT方案优于COH与诱发排卵，诱发排卵方案的不良影响最大。这一结果与其他学者们的研究[8-9]结果相同，更进一步验证了此结论的可靠性。

3.2不同用药方案对种植窗开放时间的影响多数研究[4-5]表明，在促排卵周期中，大量激素会导致种植窗开放时间较自然周期提前1～2 d。但HRT对其影响目前尚存在争议，有些学者[10]认为HRT会使种植窗延迟，另有学者[11]认为它不会对种植窗开放时间产生明显影响。

该研究对各方案的D5与D6内膜中3种蛋白的表达进行了比较，结果显示，无论哪种方案，D5与D6内膜3种蛋白的相对表达量差异均无统计学意义。这与其他学者的结果有所不同，可能原因有以下几点：①D5、D6时间较接近。延长间隔时间并且多取几个时间点，也许会发现明显差异。②实验条件稍有欠缺，未能联合电镜扫描观察胞饮突。③样本量较小。④不同方案可能会使种植窗范围扩大，只观察D5、D6可能不足以判断出种植窗开放是提前还是推迟。

综上所述，在促排卵过程中，应根据内膜情况、胚胎情况、激素水平及卵巢大小等充分评估子宫内膜容受性及患者安全性，当发现子宫内膜容受性下降，应采取全胚冷冻，之后再根据适应证选择自然周期方案或HRT方案进行[12-15]FET，从而提高受孕几率。

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(2016-12-25收稿 责任编辑王 曼)

Effects of different ovarian stimulation and hormone replacement therapy on expressions of LIF, IL-1β and integrin αVβ3 in human endometrium during the implantation window

TANLi,LIUXinyuan,CHUXiying,LUNa,XIANGYungai,SONGYuxia,LIPengfen

ReproductiveCenter,theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

induced ovulation;controlled ovarian hyperstimulation;hormone replacement therapy;endometrial receptivity

Aim: To observe the outcome of different protocols，induced ovulation, controlled ovarian hyperstimulation(COH) and hormone replacement therapy(HRT), on human endometrial receptivity during the implantation window. Methods: A total of 60 patients were enrolled, among them, 10 cases underwent induced ovulation, 20 cases underwent COH, 10 cases received HRT, and 20 cases were natural ovulation cycle. Ovarian endometrium on the 5th or 6th day(D5 or D6) after ovulation of the half subjects were collected to detect LIF,IL-1β, and integrin αVβ3 by immunohistochemical SP method, respectively. Results: The expressions of these three proteins in endometrium were natural ovulation cycle group>HRT group>COH group>induced ovulation group (P<0.05). The expressions of these three proteins in endometrium on D5 and D6 had no statistical difference(P>0.05). Conclusion: HRT might have the minest injury on the endometrial receptivity.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.022

*河南省教育厅科技攻关项目 142300410240

R715

△女，1964年4月生，博士，主任医师，教授，研究方向：辅助生殖技术与生殖内分泌，E-mail:litan668@126.com