EGCG和维生素E对孕前期铅暴露仔鼠学习记忆能力的影响*

张晓欢，孙贝贝，尹延彦，葛惠娜，李文杰#

1)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001 2)新乡医学院基础医学院 河南新乡 453003

EGCG和维生素E对孕前期铅暴露仔鼠学习记忆能力的影响*

张晓欢1)，孙贝贝1)，尹延彦2)，葛惠娜1)，李文杰1)#

1)郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室 郑州 450001 2)新乡医学院基础医学院 河南新乡 453003

EGCG；维生素E；孕前期铅暴露；小鼠；学习记忆能力；抗氧化损伤

目的：探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和维生素E(VitE)对铅暴露仔鼠学习记忆能力的影响。方法将健康SPF级昆明雌鼠随机分为对照组(4只)和染毒组(20只)。染毒组饮2 g/L醋酸铅溶液染毒21 d，对照组饮无铅去离子水21 d。染毒结束后按雌雄比21合笼饲养。分娩后第21天，将染毒组所产仔鼠随机分为7组，即生理盐水组、玉米油组、EGCG干预组(3.0 mg/kg)、VitE干预组(30 IU/kg)、联合干预1组(EGCG 3.0 mg/kg+VitE 30 IU/kg)、联合干预2组(EGCG 1.5 mg/kg+VitE 60 IU/kg)、联合干预3组(EGCG 6.0 mg/kg+VitE 15 IU/kg)，每组10只；随机选取10只对照组雌鼠所产仔鼠作为正常对照组。正常对照组仔鼠饮无铅去离子水，其余7组仔鼠灌胃相应试剂，共干预28 d。灌胃结束后，用Morris水迷宫测定小鼠学习记忆能力，用极谱仪测定小鼠血铅含量，用氧化酶试剂盒测定海马组织中SOD活性和MDA含量。结果与正常对照组相比，生理盐水组和玉米油组逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少，血铅含量升高，海马组织中SOD活性降低，MDA含量增加(P<0.05)。与生理盐水组和玉米油组相比，各干预组逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增多，血铅含量不同程度降低，联合干预1、3组SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05)。结论EGCG和VitE可能通过提高海马组织中SOD活性，改善仔鼠的学习记忆能力，对铅暴露仔鼠神经损伤有一定的保护作用。

铅是一种环境中广泛存在的重金属污染物，应用于工业、交通等许多领域。铅通过呼吸道、消化道进入人体后，主要累及神经、血液及造血、消化系统等。生长发育期的婴幼儿由于血脑屏障发育不完全，解毒功能不完善，对铅的神经毒性极其敏感[1-2]。越来越多的研究[3-4]表明，氧化应激是铅神经毒性的重要机制。茶多酚是茶叶中酚类及其衍生物的总称，表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是茶多酚中主要的活性成分[5-6]，具有显著的抗氧化、抗癌等生物活性[7]，能够改善痴呆模型小鼠的学习记忆能力和认知功能[8]。维生素E(VitE)在体内外均有很强的抗氧化作用，研究[9]证实其可预防和改善化学诱导的AD模型鼠的学习记忆能力。已有研究[10-11]表明多种抗氧化剂之间存在相互作用，使得两种或多种抗氧化剂的抗氧化效果要远远大于单一抗氧化剂的抗氧化效果。该文旨在探讨EGCG联合VitE对孕前期铅暴露仔鼠的学习记忆能力损伤和氧化损伤的干预效果。

1 材料与方法

1.1试剂和仪器醋酸铅(洛阳市化学试剂厂)，EGCG(上海晶纯试剂科技有限公司)，VitE(美国Sigma公司)，玉米油(中粮集团)。将醋酸铅和EGCG溶于生理盐水，VitE溶于玉米油。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)测定试剂盒(南京建成生物有限公司)，Morris水迷宫(北京硕林苑科技有限公司)，微量移液器(德国Eppendorf公司)，HVE-50高压灭菌用蒸汽锅(日本Hirayama公司)，797 VA极谱仪(瑞士万通)，680ELX-800型酶联免疫检测仪(美国伯乐公司)。

1.2动物模型的建立及实验分组选取SPF级昆明小鼠36只，其中雌鼠24只，雄鼠12只，购自河南省实验动物中心，动物合格证号：SYXK(豫)2012-0007。将36只小鼠在屏障环境中进行饲养，温度控制在18～22 ℃，湿度在50%～60%，昼夜周期为12 h。将雌鼠随机分为对照组(4只)和染毒组(20只)，染毒组饮2 g/L醋酸铅水溶液21 d，对照组饮无铅去离子水21 d。21 d后，每日20:00按雌雄比21合笼，次日8:00检查阴栓，阴栓不确定者做阴道涂片，确定受孕日期，孕鼠单笼饲养。染毒组仔鼠自出生第1至第21天通过乳汁染毒。仔鼠断乳后，将染毒组同窝仔鼠按体重随机分为7组，即生理盐水组、玉米油组、EGCG干预组(3.0 mg/kg)、VitE干预组(30 IU/kg)、联合干预1组(EGCG 3.0 mg/kg+VitE 30 IU/kg)、联合干预2组(EGCG 1.5 mg/kg+VitE 60 IU/kg)、联合干预3组(EGCG 6.0 mg/kg+VitE 15 IU/kg)，每组14只，分笼饲养，每天9:00灌胃相应试剂，连续灌胃28 d。对照组仔鼠随机选取14只(正常对照组)自由饮去离子水，生理盐水组灌胃等量的生理盐水，玉米油组灌胃等量玉米油。

1.3仔鼠学习记忆能力的测定灌胃结束后，对仔鼠进行Morris水迷宫实验，检测仔鼠学习记忆能力。水迷宫主要由直径130 cm、高80 cm黑色圆形水池构成，池内水深60 cm，水温控制在(22±2) ℃。整个水池分为东南西北4个象限，在第三象限正中水下2 cm处设置直径为15 cm的圆形隐藏平台，实验期间保持其位置不变。将带有显示系统的摄像机安装在迷宫上方，运用监控软件采集信息，同步记录小鼠运动轨迹。实验前一天，先将小鼠放入水中，自由游泳，适应周围环境。训练时，将小鼠从东、西、南、北不同象限池的中点放入水池开始计时，以小鼠找到平台2 s终止记录，此时间即为逃避潜伏期，训练过程中设置记录时间为60 s，若小鼠在此时间内找不到平台，则潜伏期为60 s，此时则由实验者将其放上平台适应10 s。每只小鼠每天训练4次，连续训练5 d，记录最后一次逃避潜伏期测定结果。最后一次训练结束后的第二天撤除平台，任选一个入水点将受试小鼠面向池壁放入池中，所有受试小鼠的入水点必须一致，记录60 s内小鼠穿越平台的次数，作为小鼠的空间记忆能力成绩。实验结束后每组仔鼠的数量均在10只以上，每组选取体重相差较小、出生日期相近的10只作为研究对象，记录其相关指标的检测结果。

1.4仔鼠血铅含量的测定在水迷宫实验结束后次日，对小鼠禁食，用水合氯醛进行麻醉，摘除眼球采集血液，置于含有抗凝剂的冻存管中。血液反复冻融后，取400 L加入2 mL混合酸(高氯酸与浓硝酸体积比为14)消化，然后用极谱仪测定血铅含量。

1.5仔鼠海马组织氧化应激水平的测定血样采集完成后，立即断头处死小鼠，剥离脑组织，在冰上快速分离出海马和皮层，用冰盐水冲洗，滤纸拭干，于-80 ℃冰箱中保存备用。将海马加入预冷的生理盐水中研磨成10%的组织匀浆，以3 000 r/min 离心10 min，取上清液，以Bradford法测定蛋白含量，采用黄嘌呤氧化酶法检测SOD活性，TBA法检测MDA含量，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.6统计学处理数据采用SPSS 21.0处理。8组仔鼠各指标的比较采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 8组仔鼠逃避潜伏期、穿越平台次数的比较见表1。生理盐水组和玉米油组逃避潜伏期长于对照组，穿越平台次数少于正常对照组(P<0.05)。与生理盐水组或玉米油组比较，各干预组逃避潜伏期降低，穿越平台次数增加(P<0.05)，但各干预组间比较，差异并无统计学意义(P>0.05)。

2.2 8组仔鼠血铅含量的比较见表1。生理盐水组和玉米油组血铅含量均高于正常对照组(P<0.05)。与生理盐水组或玉米油组比较，EGCG干预组和联合干预1、3组血铅含量降低(P<0.05)，而VitE干预组与联合干预2组的血铅含量变化无统计学意义(P>0.05)。

2.3 8组仔鼠海马组织中SOD、MDA含量的比较

见表1。与正常对照组相比，生理盐水组、玉米油组SOD活性降低，MDA含量升高(P<0.05)。与生理盐水组或玉米油组相比，EGCG干预组和VitE干预组二者变化无统计学意义；联合干预1、3组SOD活性升高，MDA含量降低(P<0.05)；联合干预1、3组SOD活性较两个单独干预组及联合干预2组更高(P<0.05)。

表1 8组仔鼠学习记忆能力、血铅和海马中SOD、MDA含量的比较

*：与正常对照组比较，P<0.05；#：与生理盐水组和玉米油组比较，P<0.05；△：与EGCG干预组比较，P<0.05； ▼：与VitE干预组和联合干预2组比较，P<0.05。

3 讨论

环境铅暴露对不同的生命阶段均会产生毒害作用，尤其是婴幼儿。有研究[12]表明，儿童体内血铅浓度每上升100 μg/L，智商平均下降1～3分。基于哺乳期是铅神经毒性非常敏感的窗口期理论，作者建立了一个在孕前期对母鼠进行铅暴露的模型，通过乳汁对仔鼠进行铅暴露，观察不同剂量的VitE和EGCG的干预效果。

研究结果显示，与正常对照组相比，生理盐水组、玉米油组血铅含量升高, Morris水迷宫逃避潜伏期明显延长，穿越平台次数减少；与生理盐水组和玉米油组相比，各干预组逃避潜伏期缩短，联合干预组穿越平台次数增多, 血铅含量下降但干预组之间相比，差异无统计学意义。这些研究结果提示孕前期母鼠的铅暴露可以通过乳汁使仔鼠的学习记忆能力下降，EGCG可以降低仔鼠体内血铅含量，而EGCG和VitE的干预可以拮抗铅对仔鼠学习记忆能力的损害。

氧化应激是铅神经毒性的重要机制。铅可以诱导ROS的大量产生，抑制抗氧化酶活性，使机体内氧化-抗氧化失衡，导致机体氧化损伤[13]。SOD可以清除超氧阴离子自由基，对机体的氧化-抗氧化平衡起着至关重要的作用。SOD活性间接反映了机体清除氧自由基的能力，而MDA含量又间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。研究结果显示，与正常对照组相比，生理盐水组和玉米油组仔鼠海马中SOD活性降低，MDA含量升高，这与其他研究[14-15]结果基本一致。与生理盐水组、玉米油组相比，联合干预1、3组SOD活性提高，MDA含量降低;而单独干预组、联合干预2组SOD活性和MDA含量无明显差异。

总之，EGCG和VitE可以提高海马组织中抗氧化酶的活性，改善铅暴露仔鼠的学习记忆能力，对铅暴露仔鼠神经损伤有一定的保护作用。

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(2016-12-01收稿 责任编辑王 曼)

Effects of EGCG combined with vitamin E on learning and memory ability of progestational lead-exposed newborn mice

ZHANGXiaohuan1)，SUNBeibei1)，YINYanyan2)，GEHuina1)，LIWenjie1)

1)DepartmentofNutritionandFoodHygiene,PublicHealthCollege,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001 2)CollegeofBasicMedicalSciences,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang,Henan,453003

epigallocatechin gallate;vitamin E;lead exposed during progestational;mouse;learning and memory ability;antioxidative injury

Aim: To investigate the effects of epigallocatechin gallate(EGCG) combined with vitamin E(VitE) on learning and memory ability and antioxidative damage in hippocampus of progestational lead-exposed newborn mice. Methods: A total of 20 healthy mice were exposed to 2 g/L lead acetate aqueous solution, and 4 mice were given lead-free deionized water for 21 days. After that, the female and male mice were fed in one cage with 21 ratio. At the 21th day after delivery, the offspring of lead-exposed female mice were divided into 7 groups randomly: physiological saline group, corn oil group, EGCG group(3.0 mg/kg), VitE group(30 IU/kg ), combination group Ⅰ(EGCG 3.0 mg/kg+VitE 30 IU/kg), combination group Ⅱ(EGCG 1.5 mg/kg+VitE 60 IU/kg), combination group Ⅲ(EGCG 6.0 mg/kg+VitE 15 IU/kg), and received corresponding intervention for 28 days,10 in each group;the offspring(n=10) of lead-free female mice were the normal control, and received lead-free deionized water for 28 days. After the intervention, the learning and memory ability of mice was measured by Morris water maze,the blood lead level was measured by voltammetry, and the activities of SOD and the concentration of MDA in hippocampus were measured by Oxidase Kit.Results: Compared with the normal control group, the escape latency of the physiological saline group and the corn oil group increased, the times across the platform decreased, the blood lead level and MDA concentration increased, and SOD activity decreased(P<0.05).Compared with the physiological saline group and the corn oil group, the escape latency of the 5 intervention groups dcreased, the times across the platform increased, the blood lead level reduced in different degree(P<0.05); the SOD activity of combination group Ⅰ and Ⅲ increased, and MDA concentration decreased(P<0.05).Conclusion: EGCG and VitE might improve the learning and memory ability of lead-exposed offspring mice through increasing the SOD activity in hippocampus, which could protect the lead-exposed offspring mice from nerve damage.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.05.014

R179

*国家自然科学基金资助项目 81172716

#通信作者，男，1958年11月生，博士，教授，研究方向：营养与相关疾病，E-mail:lwj@zzu.edu.cn