不同频率音乐对小鼠空间学习记忆能力的影响

袁徐蕾，杨 梅，韩文莉，谭冬梅，范 尧*，谭 毅*

(1.重庆医科大学公共卫生与管理学院，重庆 400016； 2.重庆医科大学实验动物中心，重庆 400016)

研究报告

不同频率音乐对小鼠空间学习记忆能力的影响

袁徐蕾1，杨 梅1，韩文莉2，谭冬梅2，范 尧1*，谭 毅2*

(1.重庆医科大学公共卫生与管理学院，重庆 400016； 2.重庆医科大学实验动物中心，重庆 400016)

目的初步探究音乐对成年小鼠学习记忆能力是否产生影响。方法80只C57小鼠随机分成10组，每组雌雄各半。空白对照组：不给予音乐刺激，高频音乐3组、中频音乐3组、低频音乐3组，分别用高频、中频、低频各3首进行音乐刺激，每天5 h，连续6 d。第7天进行水迷宫测试，期间保持音乐刺激不变，测试指标为潜伏期，经过平台次数和平台象限停留时间。结果音乐组与空白组相比，小鼠逃避潜伏期明显缩短(P< 0.05)，经过平台次数和平台象限停留时间虽有增多，但差异无显著性(P> 0.05)。各音乐组之间检测指标差异无显著性(P> 0.05)。结论所选9首音乐能提高成年小鼠学习记忆能力，而不同频率音乐之间产生的影响未发现显著性差异。推测音乐刺激对小鼠的影响与音乐分类的标准、刺激周期长短、刺激时间点选择等因素密切相关。

音乐；频率；学习记忆能力

学习和记忆能力的提高一直是人们关注的热点，其影响因素包括情绪、内分泌、运动、训练以及诸多环境因素。音乐作为一种艺术形式，具有特殊的治疗作用，能够对人的生理和心理产生积极影响，调节人的情绪、血压、心率以及应激水平等[1-2]。动物实验发现，音乐可以促进大鼠和小鼠的大脑发育，增强神经的可塑性，提高其空间的学习和记忆能力。听觉皮层NMDA受体(N-methyl-D-aspartate receptor)是包括人类在内的哺乳动物学习和记忆过程中一类至关重要的神经连接通路，2周龄大鼠聆听莫扎特的《D大调双钢琴奏鸣曲K.448》之后，听觉辨别学习能力增强，NMDA的亚单位NR2B蛋白的表达显著增加[3]。小提琴协奏曲《梁祝》作为刺激音乐可以提高大鼠的空间记忆能力，记忆能力的提高依赖于音乐刺激时间的长短，并与海马结构中NMDA受体表达上调有关[4]。迄今的研究发现，不同音乐对大小鼠大脑发育的影响效果并不一致，《梁祝》能明显提高成年昆明小鼠的空间记忆能力,而《莫扎特D大调小提琴协奏曲》的效果却不明显[5]。莫扎特音乐和《梁祝》均能增强雄性老年Wistar大鼠的学习记忆能力，而摇滚音乐的效果不明显[6]。

音乐对大小鼠空间学习和记忆能力具有一定正性影响的初步试验结果提示，对音乐的治疗效果值得深入研究。研究方案中涉及许多因素的选择，包括音乐片段、音乐刺激时间、刺激方式、受试动物、评价模型等等。音乐是由频率、节奏、旋律、音色、音准等元素构成的复杂艺术形式[7]，在音乐治疗过程中，不同构成元素产生的效果存在差异[8]。人类的声频范围为20 Hz～20 000 Hz，最敏感的频率区间是1000 Hz～4000 Hz，低于20 Hz的声波叫次声波，高于20 000 Hz的声波叫超声波，都超出了人耳的听觉能力。啮齿类动物的声频范围为200 Hz～90 000 Hz[9]，对高频声波反应灵敏。目前已有研究在音乐选取方面较为单一，很少专门考虑所选音乐中的频率成分，本研究采用软件将音乐分析之后分为高频、中频、低频3个组，对C57小鼠进行短期刺激，通过Morris水迷宫的行为学评价，探究不同频率音乐对小鼠学习记忆能力的影响，为音乐在临床治疗的应用提供实验依据。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 实验动物

SPF级C57小鼠80只，6～8周龄，体重20～25 g，雌雄各半，来源于重庆医科大学实验动物中心 [SCXK (渝) 2012-0001]。饲养观察于IVC笼架里 [SYXK (渝) 2012-0001]。

1.1.2 实验仪器

山水(Sansui)A38S迷你插卡小音箱(山水电子有限公司)；众实ZS-001 Morris水迷宫(成都泰盟科技有限公司)；泰仕声量计(台湾泰仕电子工业股份有限公司)。

1.2实验方法

1.2.1 音乐选取与分类

研究人员使用Cool Edit Pro软件对多首经典钢琴曲目进行分析，最终选出9首曲目用于实验，分为高频音乐组(主要频率在3000～4000 Hz)3首：《土耳其进行曲》(KV.331)(莫扎特)，《小狗圆舞曲》(Op.64, No.1)(肖邦)，《春节序曲》(李焕之)；中频音乐(主要频率在2000～3000 Hz)3首：《夜曲》(Op.9, No.1)(肖邦)，《夜曲》(Op.9, No.2)(肖邦)，《钢琴奏鸣曲》(KV.457-II)(莫扎特)；低频音乐(主要频率在2000 Hz以下)3首：《葬礼进行曲》(Op.35)(肖邦)，《森林情景——恶名昭彰的地方》(Op.82)(舒曼)，《致野玫瑰》(Op.51)(麦克道威尔)，见图1。

注：a：《土耳其进行曲》；b：《小狗圆舞曲》；c：《春节序曲》；d：《夜曲》(Op.9, No.1)；e：《夜曲》(Op.9, No.2)；f：《钢琴奏鸣曲》；g：《葬礼进行曲》；h：《森林情景——恶名昭彰的地方》；i：《致野玫瑰》(Op.51)。图1 音乐频率分组图Note. a: Turkish March (KV.331); b: Minute Waltz (Op.64, No.1); c: Spring Festival Overture; d: Nocturne (Op.9, No.1); e: Nocturne (Op.9, No.2); f: Piano Sonata (KV.457-II); g: Funeral March (Op.35); h: Forest Scenes (Op.82); i: To a Wild Rose (Op.51).Fig.1 Types of the music of high-, medium- and low-frequency

1.2.2 分组

将80只小鼠随机分为10组，雌雄各半，分别为：空白对照组、高频音乐组1、高频音乐组2、高频音乐组3、中频音乐组1、中频音乐组2、中频音乐组3、低频音乐组1、低频音乐组2、低频音乐组3。每组两笼，每笼4只，分别饲养于IVC鼠笼中，自由进水进食。

1.2.3 干预措施

将小音箱用胶带固定在IVC笼盒的侧壁上，声量计测得音箱关闭时每个笼盒中的声响为45～50 dB，笼盒外声响为50 dB。音乐播放时笼盒内声音响度为60～70 dB，笼盒外环境噪声仍为50 dB，各组小鼠接受音乐刺激时互不干扰。

每天上午9:00～11:30，下午15:00～17:30各音乐组IVC鼠笼中的音箱分别播放相应音乐曲目，空白组放置相同音箱但保持关闭，持续6 d，期间小鼠自由进食进水。

1.2.4 Morris水迷宫测试

测试期间保持音乐刺激不变。迷宫内加入清水和少量伊利纯牛奶，控制水温在18℃～22℃,水面高出平台约1 cm，肉眼看不见平台。自动记录仪最大潜伏期设为90 s。

定位航行实验：干预6 d后开始进行。第7～10天的每天早上9:00开始进行。分别从水池东南西北4个入水点将小鼠背向平台放入水池中，观察并记录小鼠找到并爬上平台所需时间，即逃避潜伏期。90 s内找不到平台者，将其引上平台，并使其在平台上停留10 s。连续测试4 d。

空间探索实验：第11天进行。撤去平台，将小鼠从原平台相对的位置背向平台放入水池中，通过系统记录并分析小鼠在90 s内的游泳轨迹，计算小鼠经过平台所在位置的次数和在平台象限游泳的时间。

1.3统计学方法

2 结果

定位航向实验中，各音乐组与空白组相比，第1～4天潜伏期明显缩短(除个别组P略大于0.05外，其它均为P< 0.05)。而各音乐组之间潜伏期差异无显著性(P> 0.05)(表1)。

空间探索实验中，经过平台次数和平台象限停留时间各组间差异无显著性(P> 0.05)，但仍显示音乐组穿越平台次数和平台象限停留时间的值较空白组大(表2)。

3 讨论

学习和记忆是一个由脑支配的复杂过程。已有研究表明，脑内多种成分参与了该过程，包括相关神经递质、蛋白质、神经肽以及RNA等[10]。音乐作为一种艺术形式，已不仅限于艺术欣赏和审美领域，而是逐步渗透到医疗、心理等领域[11]。国内外多项研究表明，出生后的早期音乐刺激，可增强大鼠NMDA受体介导的神经可塑性，增强其在听觉分辨学习任务中的能力[12]。围产期的音乐刺激，既有助于抵抗大鼠由于胼胝体离断术造成的空间记忆能力下降[13]，也可通过影响BDNF/TrkB细胞内信号传导通路，诱导小鼠学习记忆功能力提升[14]。同时，成年小鼠在接受连续30 d的莫扎特K 448奏鸣曲刺激后，海马、大脑皮质基因表达受到显著影响，空间记忆能力和恐惧刺激记忆也得到提高[15]。

Tab.1The avoiding latency of mice in each group in the Morris water maze test

组别Groups第一天1stday第二天2ndday第三天3rdday第四天4thday空白组Controlgroup8398±12825885±21524682±15563782±1175低频音乐组1Group1oflow⁃frequencymusic6804±2977∗4676±29563034±2296∗2171±1907∗低频音乐组2Group2oflow⁃frequencymusic6581±3101∗4300±22183561±28512249±1918∗低频音乐组3Group3oflow⁃frequencymusic6546±3205∗4610±2124∗3337±1669∗2382±1217∗中频音乐组1Group1ofmedium⁃frequencymusic6535±3259∗4493±2269∗3412±2785∗2392±2155∗中频音乐组2Group2ofmedium⁃frequencymusic6759±2650∗4375±2839∗3462±18062238±1964∗中频音乐组3Group3ofmedium⁃frequencymusic6723±2934∗4348±3295∗3262±2738∗2397±1922∗高频音乐组1Group1ofhigh⁃frequencymusic6626±3404∗4262±3303∗3446±20412281±1973∗高频音乐组2Group2ofhigh⁃frequencymusic6677±3010∗4508±2422∗3264±1761∗2422±1555∗高频音乐组3Group3ofhigh⁃frequencymusic6945±2743∗4342±2730∗3287±2075∗2414±1945∗

注：与空白组比较，*P< 0.05。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05.

Tab.2Frequency of passing the platform and time spent to pass the quadrant of mice in each group in the Morris water maze on the 5th day

组别Groups平台象限活动时间/sTimeforpassingthequadrant虚拟平台穿越次数Frequencyofpassingtheplatform空白组Controlgroup1303±269300±245低频音乐组1Group1oflow⁃frequencymusic1929±684425±212低频音乐组2Group2oflow⁃frequencymusic1679±758375±244低频音乐组3Group3oflow⁃frequencymusic1428±591425±183中频音乐组1Group1ofmedium⁃frequencymusic1813±172513±290中频音乐组2Group2ofmedium⁃frequencymusic1457±246388±217中频音乐组3Group3ofmedium⁃frequencymusic1454±514613±340高频音乐组1Group1ofhigh⁃frequencymusic1759±816488±348高频音乐组2Group2ofhigh⁃frequencymusic1429±452456±350高频音乐组3Group3ofhigh⁃frequencymusic1656±536488±203

音乐分类方式多种多样，不同风格的音乐刺激效果不同。有学者研究莫扎特K.250的高、中、低频段对高血压大鼠的降压效果，发现高频段音乐降压效果相对较好，认为高频段可能是莫扎特音乐对脑功能产生影响的基础[16]。张峰等[17]在研究不同频率音乐对肉鸡生产性能时，发现高频和低频音乐组肉鸡采食量显著高于次声频率和中频组。本研究针对不同频率音乐进行分组，并进行探究。为排除不同乐器的音色可能造成的干扰，所选音乐皆为经典钢琴曲目。钢琴的声频范围为27.5～4186 Hz[18]。实验结果表明，音乐组小鼠的空间学习记忆能力相比空白组得到了明显增强，说明音乐在一定程度上兴奋了脑内相关成分，进一步证实其在提高学习记忆能力方面的作用。但高频、中频、低频音乐组之间没有发现显著差异，这与其它研究结果存在一定差距。可能的原因有，小鼠的听阈范围为200～90 000 Hz，远高于人类，实验所选不同频率音乐的频率间隔范围相对较小，可能均远低于其最适听阈；与其它实验相比，本研究给予小鼠的音乐刺激时长较短(5 h/d，持续6 d)，可能还不足以改变小鼠相应生理因素；9首曲目除在频率上存在差异外，其它音乐元素也都不尽相同，《春节序曲》为中国民族音乐，其余为西方古典音乐，音乐风格不完全一致，从而造成各音乐组之间的差异不明显。

迄今为止，用于动物实验或临床试验的音乐没有统一、明确的分类标准，使用的音乐曲目数量较少，种类局限。鉴于动物听觉中枢神经元对于声音刺激的频率、时间、强度、空间信息等编码过程与人类的差异[19]，各音乐元素对动物和人类产生的具体作用还有待进一步研究。本研究选用正常人类音乐中不同频率范围的曲目，仅对频率这一音乐元素进行了初步探究，具有一定局限性。动物与人类在听阈范围存在较大差异，更高频率范围的音乐或者使用专业软件对已有音乐作品中的频率进行倍增之后的音乐值得在动物实验中继续尝试。

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Impactofmusicofdifferentfrequenciesonthespatiallearningandmemoryabilityofmice

YUAN Xu-lei1， YANG Mei1， HAN Wen-li2， TAN Dong-mei2， FAN Yao1*， TAN Yi2*

(1.School of Public Health and Management, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China； 2.Laboratory Animal Center, Chongqing Medical University, Chongqing 400016)

ObjectiveTo explore the impact of music of different frequencies on the spatial learning and memory ability of mice.MethodsA total of 80 healthy 6～8 weeks old C57 mice were randomly divided into 10 groups, half male and half female in each group. The mice in the control group were not stimulated by music. The mice of the 3 groups of high-frequency music, 3 groups of medium-frequency music and 3 groups of low-frequency music were stimulated by music in corresponding range of frequency, respectively, for 5 h each day. After 6 d, the ability of spatial learning and memory of the mice was tested in the Morris water maze, with the same stimulation of music during the test. The indicators of the test included the avoiding latency, the frequency of passing the platform and the time spent to pass the quadrant of the mice in each group.ResultsCompared with the control group, the avoiding latency of the mice in the groups with stimulation by music was significantly shorter (P< 0.05). The frequency of passing the platform and the time spent to pass the quadrant were increased, yet the difference was not significant (P> 0.05). Moreover, there was no significant difference between the indicators of the 9 groups receiving music stimulation (P> 0.05).ConclusionsThe 9 pieces of music we have selected can improve the ability of spatial learning and memory in adult mice, however, the effects of the music of different frequencies did not show significant difference. It is hypothesized that the impact of music stimulation on mice may be related to the criteria for music classification, the duration of cycle of music stimulation and the selection of time points of stimulation.

Music; Frequency; Learning and memory ability

R-33

A

1671-7856(2017) 09-0071-05

10.3969.j.issn.1671-7856.2017.09.013

2016-09-07

重庆市科委社会民生项目(编号：cstc2017shmsA0007)；重庆医科大学大学生科学研究与创新实验项目(编号：201663)。

袁徐蕾(1996-)，女，本科生，专业：口腔医学。E-mail: yuan.xulei@qq.com

范尧(1974-)，女，副教授，研究方向：音乐治疗学,E-mail: fanyaofanyao@126.com； 谭毅(1966-)，男，研究员，研究方向：实验动物模型，E-mail:tanyee66@126.com*共同通讯