从雌激素受体探讨解毒祛瘀滋阴药对SLE的治疗机制*

王大维 汪梅姣 谷焕鹏 温成平

（浙江中医药大学基础医学院，浙江 杭州 310053）

·研究报告·

从雌激素受体探讨解毒祛瘀滋阴药对SLE的治疗机制*

王大维 汪梅姣 谷焕鹏 温成平△

（浙江中医药大学基础医学院，浙江 杭州 310053）

目的 观察解毒祛瘀滋阴药含药血清对雌激素受体α和β及其相关通路的调节作用，从而探讨解毒祛瘀滋阴药治疗系统性红斑狼疮（SLE）的机制。方法 CCK-8法检测研究解毒祛瘀滋阴药含药血清对MCF-7细胞增殖的影响；以FITC-Annexin V/PI双染法流式细胞术检测10%解毒祛瘀滋阴药含药血清诱导MCF-7细胞的凋亡率；Realtime-PCR法检测ERα和PI3KmRNA的表达；Western blot法检测雌激素受体相关信号通路蛋白ERα、p-ERα、ERβ、ERK、p-ERK的表达。结果 10%和15%的解毒祛瘀滋阴药含药血清与空白血清相比均能较轻的抑制MCF-7细胞的增殖 （P＜0.01）。与空白血清相比，10%的解毒祛瘀滋阴药含药血清：使MCF-7细胞的早期凋亡较多；使ERα和PI3K的mRNA相对表达量明显降低（P＜0.05或P＜0.01）；使ERα的蛋白表达和磷酸化水平降低；使ERβ的蛋白表达水平升高；使ERK的蛋白表达和磷酸化水平降低。结论下调ERα的表达和其磷酸化水平，促进ERβ的表达，下调ERK及其磷酸化进而影响MAPK/ERK信号通路也许是解毒祛瘀滋阴药治疗SLE的部分机制。

解毒祛瘀滋阴药 雌激素受体 信号通路 系统性红斑狼疮

系统性红斑狼疮（SLE）是一种典型的自身免疫性结缔组织病，可累及全身各个系统。SLE病情易迁延反复，严重危害着患者的生活质量，且发病率呈逐年上升的趋势，尤其好发于育龄期女性，患者男女比例约为1∶7～9［1］。SLE 病因复杂，除了遗传因素、环境因素之外，雌激素被认为是影响SLE发生发展的重要因素之一［2-3］。妊娠期患者病情明显加重，而绝经后的患者病情有不同程度的缓解［4］。众多临床研究证明雌激素从不同环节影响着SLE。本课题组长期以来的临床研究发现解毒祛瘀滋阴药对SLE的疗效明显，并且发现其对雌激素有调节作用［5］。因此本文从雌激素受体的调节来探讨其治疗SLE的机制。由于外周血中提取的T、B细胞培养过程中死亡速度较快，导致检测指标不稳定，难以明确数据波动原因，MCF-7细胞既表达雌激素受体α（ERα），又表达雌激素受体 β（ERβ），是研究雌激素受体（ER）相关通路的良好模型。于是本课题组选取表达雌激素受体的人乳腺癌MCF-7细胞作为载体，并加雌激素模拟体内环境，以含解毒祛瘀滋阴药的大鼠血清为主要干预因素进行研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验细胞和动物 人乳腺癌MCF-7细胞购于中国科学院上海细胞库。培养条件：含胎牛血清（FBS）10%的DMEM高糖培养基（青霉素1×105U/L、链霉素100 mg/L），饱和湿度、37 ℃、5%CO2。 培养基一般隔天更换。当细胞汇合约90%时传代。选取对数生长期细胞进行实验。Wistar大鼠，购于浙江中医药大学实验动物中心。

1.2 试药与仪器 解毒祛瘀滋阴方生药购于浙江中医药大学中药饮片厂；DMEM高糖培养基、PBS、0.25%Trypsin均购自于吉诺生物医药技术有限公司；胎牛血清，美国 GEMINI公司；17β-雌二醇（E2），Sigma-Aldrich；CCK-8试剂盒，碧云天生物技术研究所；逆转录试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司；Realtime-PCR试剂盒，美国BIO-RAD公司；ERα抗体、p-ERα抗体（phospho S106）、ERβ 抗体 （ab92306）、Akt抗体、ERK 抗体、p-ERK1（pT202/pY204）/ERK2（pT185/pY187）抗体，均购自于英国Abcam公司；引物设计与合成，生工生物工程（上海）股份有限公司。荧光倒置显微镜，Olympus；CO2培养箱，Thermo Scientific；超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；Scientific Varioskan flash多功能酶标仪，Thermo；Realtime-PCR 仪，BIO-RAD； 槽式转印系统，BIO-RAD；双通道红外扫膜仪（Odyssey），Licon。1.3 含药血清的制备 解毒祛瘀滋阴方1剂以单蒸水800 mL煎煮1 h，共煎2次，将2次的中药水煎剂混合后，再以R202型旋转蒸发器将中药水煎剂浓缩成4 g/mL。取20只Wistar大鼠，随机分为空白组和中药组，每组10只。中药组按人等效剂量的16倍生药剂量灌胃解毒祛瘀滋阴方水煎剂；空白组以同等体积的生理盐水灌胃。每日1次，前6 d灌胃期间正常饲养。第7日灌胃前禁食12 h（自由饮水），灌胃1 h后心脏采血。血液室温静置45 min，3000 r/min离心30 min。吸取上清，同组上清合并，并于56℃水浴30 min灭活。于超净工作台内以0.22 μm孔径滤膜过滤除菌，分装，得到空白血清和含药血清，-80℃保存。

1.4 CCK-8法检测细胞增殖 取对数生长期细胞，以5000/孔接种于96孔板，每孔液体总量为100 μL。接种12 h后分组用药。1）空白组：100 μL DMEM高糖培养基（含10%FBS），不含细胞和药物。2）空白对照组：正常培养的人乳腺癌MCF-7细胞；3）空白血清组：正常培养的人乳腺癌MCF-7细胞加10%（体积比）的空白血清；4）10%含药血清组：正常培养的人乳腺癌MCF-7细胞加10%的含药血清。5）15%含药血清组：正常培养的人乳腺癌MCF-7细胞加15%的含药血清。各组均加E2：300 pg/mL，并设3个复孔。用药干预24 h后，每孔加10 μL的CCK-8，继续培养1 h。摇床低速摇10 min，用酶标仪以450 nm检测各孔吸光度值（A450）。实验重复3次。细胞存活率的计算：细胞存活率（%）=（实验组 A450 均值-空白组 A450 均值）/（空白对照组A450均值-空白组A450均值）×100%

1.5 流式细胞术检测MCF-7细胞的凋亡 取对数生长期细胞，以1×105/mL种于六孔板，培养12 h后按实验分组用药，分别为空白对照组，含10%FBS的DMEM高糖培养基；空白血清组，含10%空白血清的DMEM高糖培养基；含药血清组，10%含药血清的DMEM高糖培养基；各组均加E2：300 pg/mL。药物作用24 h后以不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化，1000 r/min离心5 min，收集细胞。预冷的PBS漂洗细胞，离心弃上清，以 1×Binding Buffer 100 μL 重悬细胞。每管加入 5 μL FITC Annexin V，室温避光孵育10～15 min。上机前5 min每管加入 5 μL PI，而后 1×Binding Buffer 400 μL 混匀，上机检测。正常培养的MCF-7细胞分为3组：阴性对照组，即不加荧光染料的细胞；Annexin V-FITC组；Annexin V-PI组。

1.6 Realtime-PCR法检测ERα和PI3K的表达 取对数生长期细胞，以1×105/mL种于六孔板，培养12 h后分为3组，分组同前（同流式细胞术检测）。每组均加E2：300 pg/mL。每组3个复孔。继续培养24 h后以Trizol提取总RNA。按逆转录试剂盒说明书，选30 μL体系，加1.5 μg总RNA进行逆转录。逆转录条件为：37℃，15 min；85℃，5 s；4℃冷却；-20℃保存。PCR 引物如下，GAPDH，F：CTGCCAACGTGTCAGT。 R：GTTG AGGGCAATGCCA；ERα。F：AGATAATCGACGCCAGG GTG。 R：AGCATAGTCATTGCACACTGCAC。 PI3K，F：ATGGGGATGATTTACGGC。 R：TCTCCTTTGTTCTTGT CTTTGA。PCR反应体系20 μL，反应条件：预变性94 ℃，5 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，15 s； 扩增40个循环；72℃，10 min。溶解曲线条件：以60℃为初始温度，每隔30 s升高0.5℃，直到温度升至95℃。空白血清组和含药血清组的目的基因相对于正常组的表达量通过 2-△△Ct计算得出。△△Ct=（Ct目的基因-Ct内参基因）血清组-（Ct目的基因-Ct内参基因）空白对照组。

1.7 Western blot法检测雌激素受体相关蛋白的表达上述各组细胞以相应药物作用48 h后，以0.25%Trypsin消化，1000 r/min离心5 min收集细胞，以4℃预冷的PBS漂洗。而后每孔细胞（六孔板）用预冷的RIPA 200 μL （含 1%PMSF） 在冰上裂解 30 min，12000 r/min，4 ℃离心 15 min， 小心吸取上清 100 μL。Bradford法测各样本的蛋白浓度，以生理盐水调整使浓度一致。将各组样本以5×Loading buffer混匀，金属浴加热100℃10 min充分变性。10%SDS-PAGE凝胶电泳分离，电泳条件：60 V，约30 min；湿转法80 V，2 h，将凝胶中的蛋白转至NC膜；5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST漂洗。 一抗孵育：4℃，12 h；漂洗后，荧光二抗室温避光孵育2 h；漂洗后以双通道红外扫膜仪扫描。

1.8 统计学处理 应用SPSS19.0和Excel2007统计软件。多组间比较采用单因素方差分析 （one-way anova）。 计量资料以（±s）表示，显著性检验水准为0.05（双侧）。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 解毒祛瘀滋阴药含药血清对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响 见表1。CCK-8检测结果显示，与空白血清相比10%的含药血清和15%的含药血清均使人乳腺癌MCF-7细胞的增殖活性降低（P<0.01），差异有统计学意义。其中15%的含药血清虽然比10%的低，但二者相比差异无显著性（P＞0.05），本实验目的是研究雌激素受体相关通路而不是增殖抑制，故后续实验中以10%的含药血清进行干预。

表1 解毒祛瘀滋阴药含药血清对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响（s）

表1 解毒祛瘀滋阴药含药血清对人乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响（s）

与对照组和空白血清组比较，**P＜0.01。下同。

组 别 n OD值 存活率（%）空白对照组 3 0.436±0.001 100.00±0.23空白血清组 3 0.404±0.002 92.75±0.75 10%含药血清组 3 0.368±0.004** 84.58±1.17**15%含药血清组 3 0.358±0.006** 82.11±1.62**

2.2 解毒祛瘀滋阴药含药血清对MCF-7细胞凋亡的影响 见图1，表2。以FITC-Annexin V/PI双染法流式细胞术检测解毒祛瘀滋阴药含药血清对MCF-7细胞凋亡的影响，见图1。空白血清和含药血清都能诱导MCF-7细胞凋亡，含药血清组的总凋亡率最高。对FITC/PI双荧光参数散点图分析早期凋亡和晚期凋亡的分布结果见表2。与空白对照组和空白血清组相比，含药血清主要引起早期凋亡。

图1 FITC-Annexin V/PI双染法流式细胞术检测凋亡率

表2 流式细胞术检测各组细胞凋亡比例s）

表2 流式细胞术检测各组细胞凋亡比例s）

组 别 n 正常活细胞 早期凋亡细胞 晚期凋亡细胞 总凋亡率（%）坏死细胞空白对照组 3空白血清组 3 83.57±1.90 7.37±0.95 5.50±0.53 74.60±0.75 12.47±0.66 7.10±0.70 12.87±1.40 3.43±0.76 19.57±1.25 5.83±0.71含药血清组 371.00±1.08 20.63±1.98** 5.17±0.5025.80±1.49**3.23±0.74

2.3 Realtime-PCR法检测解毒祛瘀滋阴药含药血清对ERα和PI3K表达的影响 见表3。以目的基因和GAPDH 的 Ct差值，采用双 DELT 法（2-△△Ct）计算实验组目的基因相对于空白对照组的表达量。与空白对照组相比，ERα的mRNA表达量在空白血清组和含药血清组均显著降低（P<0.01）；PI3K的mRNA表达量，空白血清组升高（P＞0.05），含药血清组表达明显降低（P<0.01）。含药血清组与空白血清组相比，ERα和PI3K的mRNA表达量均降低，且差异有统计学意义（P<0.05 或 P<0.01）。

表3 各组ERα和PI3KmRNA相对表达量比较s）

表3 各组ERα和PI3KmRNA相对表达量比较s）

与空白血清组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与空白对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。 下同。

组 别 n ERα PI3K空白对照组 3 1 1空白血清组 3 0.48±0.05△△ 1.32±0.17含药血清组 3 0.31±0.06△ 0.27±0.02△△

2.4 解毒祛瘀滋阴药含药血清对雌激素受体相关蛋白表达的影响 见图2，图3。对ERα、p-ERα、细胞外调节蛋白激酶（ERK）、磷酸化的细胞外调节蛋白激酶（p-ERK）、以及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（AKT）的影响，见图2。由图可知与空白对照组和空白血清组相比，10%的解毒祛瘀滋阴药含药血清干预MCF-7细胞24 h后，可以使ERα的蛋白表达和其磷酸化水平降低，使ERK的蛋白表达和其磷酸化水平明显降低，而对AKT的蛋白表达几乎没有影响。与空白血清组相比，含药血清可以使ERβ表达升高，见图3。

图 2 ERα、p-ERα、ERK、p-ERK、AKt蛋白的表达

图3 ERβ的蛋白表达

3 讨 论

有Meta分析认为雌激素与SLE的进展有明显的因果关系［6］。目前认为雌激素受体主要分为两种亚型：α型和β型，在生殖、呼吸、心血管以及骨骼等不同的组织或细胞中表达程度不同，生物学效应也不同［7］。它们不仅仅存在于细胞核也存在于细胞膜、细胞质以及线粒体。雌激素与受体结合后，通过与靶基因雌激素反应元件（ERE）的结合，激活或者抑制靶基因的调控区，实现对靶基因表达的调节，此途径称为雌激素受体作用机制的经典基因组途径，除此之外还有非经典的基因组途径和非基因组途径［8-9］。ERα和ERβ均形成同型或者异型二聚体而发挥作用。已有的研究表明，ERβ对ERα有抑制作用，而且会降低细胞对雌激素的敏感性［10］。 ERβ 的激活也会起到一定的抗炎作用［11］。ERα的活性升高会降低ERβ的稳定性［12］。在SLE的模型动物敲除ERα后蛋白尿和ds-DNA抗体明显降低［13］。似乎ERα/ERβ的比值升高不利于 SLE。但是当ERα不表达时，ERβ可替代ERα的部分作用，说明二者之间呈现的是此消彼长的关系，在某些情况下相互拮抗，有时又互相补充。

ER的快速效应被认为是通过细胞膜上雌激素受体（mER）的非基因组途径来实现的，E2与mER结合后可以活化MAPK信号通路以及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT信号通路。后来Thomas研究表明ERβ1可以通过促进c-Cb-1对EGFR的降解而使ERK1/2失活［14］。ERK 属于丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族，其中ERK1和ERK2目前研究的比较透彻。我们的研究结果表明解毒祛瘀滋阴药的含药血清可以使ERβ表达升高，而ERK和p-ERK的表达均降低。由Thomas的研究结果推断，滋阴药的含药血清使ERK和p-ERK的表达降低是也许由于促进了ERβ的表达而导致的。

MAPK信号通路在细胞的生长、分化、迁移、死亡等方面都起着重要的调节作用。MAPK的级联反应又可以使nER磷酸化，磷酸化的nER激活Pak1、PkA和AKT等［15］。所以雌激素受体的基因组途径和非基因组途径以及MAPK/ERK通路和PI3K/AKT通路之间存在着复杂的相互联系。

PI3K活化后产生第二信使PIP3，后者结合并活化AKT并可以使AKT转移到细胞膜上。活化的AKT磷酸化ERα的AF-1区中的丝氨酸残基，从而调节ERα。Sandra等研究发现PI3K的抑制剂LY294002可以使AKT、p-AKT下调，而且ERα总蛋白和p-ERα也下调［16］。这表明ERα和PI3K/AKT信号通路之间可以形成相互调节相互影响的环路。我们的实验结果显示，解毒祛瘀滋阴药含药血清使PI3K的mRNA和ERα蛋白以及p-ERα表达下调，这有可能对ERα-PI3K/AKT这一环路产生了影响。

综上所述，下调ERα的表达和其磷酸化水平，促进ERβ的表达，下调ERK及其磷酸化进而调节MAPK/ERK信号通路以及ERα-PI3K/AK环路，这也许是解毒祛瘀滋阴药治疗系统性红斑狼疮的部分机制。但是ERβ的调控机制目前仍然没有定论，对ERβ的认识仍然比较狭窄，还有待于深入研究。

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Exploration on the Mechanism of Jiedu Quyu Ziyin Decoction on SLE from Estrogen Receptor

WANG

Dawei，WANG Meijiao，GU Huanpeng，et al. Basic Medical College of Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang，Hangzhou 310053，China.

Objective： To study the regulation of of Jiedu Quyu Ziyin Decoction （JQZR） on estrogen receptor α and β and their related pathways in the serum，and to explore the mechanism of JQZR on SLE.Methods： CCK-8 method was used to detect the proliferation of MCF-7 cells.The FITC-Annexin V/PI double staining method was used to detect the apoptosis rate of MCF-7 cells induced by medicated serum containing 10%JQZR.The expression of mRNA of ERα and PI3K was detected by Realtime-PCR.The expression of ERα，p-ERα，ERβ，ERK and p-ERK were detected by Western blot.Results：The proliferation of MCF-7 cells was significantly inhibited by 10%and 15%of JQZR Compared with the blank serum（P<0.01）.Compared with the blank serum，medicated serum of 10%JQZR made MCF-7 cells more early apoptosis and mRNA expression of ERα and PI3K was significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）.The protein expression and phosphorylation levels of ERα decreased.Protein expression levels of ERβ increased and protein expression and phosphorylation levels of ERK decreased.Conclusion： Down-regulation of ERα expression and phosphorylation level，promotion of ERβ expression，downregulation of ERK and its phosphorylation and regulation of the signaling pathway of MAPK/ERK may be part of the mechanism of JQZR on SLE.

Jiedu Quyu Ziyin Decoction（JQZR）；Estrogen receptor；Signaling pathway；Systemic lupus erythematosus（SLE）

R593.24+1

A

1004-745X（2017）09-1505-05

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.09.001

2017-05-26）

国家自然科学基金项目（81373633）；浙江中医药大学校级科研基金项目（2012ZY01）

△通信作者（电子邮箱：wengcp@163.com）